Large Scale zebravis-Based In vivo Kleine Molecule Screen

Summary

Zebravis heeft ontpopt als een krachtig<em> In vivo</em> Platform voor fenotype-based drug-schermen en chemische genetische analyse. Hier demonstreren we een eenvoudige, praktische methode voor grootschalige screening van kleine moleculen met behulp van zebravis embryo's.

Abstract

Gezien hun geringe omvang embryo, snelle ontwikkeling, transparantie, vruchtbaarheid, en tal van moleculaire, morfologische en fysiologische overeenkomsten met zoogdieren, heeft zebravis ontpopt als een krachtig<em> In vivo</em> Platform voor fenotype-based drug-schermen en chemische genetische analyse. Hier demonstreren we een eenvoudige, praktische methode voor grootschalige screening van kleine moleculen met behulp van zebravis embryo's.

Protocol

1) zebravis Ei Collectie Op de middag voorafgaand aan de dag van de chemische scherm, opgezet 10 tot 20 zebravis kweekbakken. Vul elke tank met water uit de aquacultuur systeem. Met behulp van een visnet, overdracht een volwassen man en een tot twee volwassen vrouwtjes tot innerlijke container in elk kweekbak. Scheiden de mannelijke en vrouwelijke vis uit elkaar met een divider. Het etiket van de kooien en doe een deksel over hen. Op de ochtend van het scherm, verwijder de verdelers van de kweekbakk…

Discussion

Bij het plannen van een zebravis-gebaseerde chemische scherm, moet bijzondere aandacht worden besteed aan de robuustheid van het fenotype in kwestie en de achtergrond van een dergelijke snelheid fenotype. Dit is vooral van belang voor schermen voor chemische onderdrukkers van een geïnduceerde fenotype. Bijvoorbeeld, voor een fenotype veroorzaakt door hitte-shock inductie van een transgen, de voorwaarde dat het fenotype induceert reproduceerbaar moet precies in kaart worden gebracht voordat wordt begonnen met het scherm…

Materials

1. Minimum of 20 pairs of adult zebrafish of desired genotype.
2. Fish nets, Breeding tanks, with removable inner container and dividers (Aquatic Habitats).
3. Petri dishes (10 cm).
4. Plastic tea strainer.
5. Wash bottle containg embryo water.
6. Disposable polyethylene transfer pipettes.
7. Polystyrene 96-well round-bottom assay plates (Corning COSTAR; Lowell, MA).
8. Glass Pasteur pipette (Fisher Scientific).
9. Manual pipette pump, 10 mL (Bel-Art Products, Pequannock, NJ).
10. E3 embryo medium: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl₂ , 0.33 mM MgSO₄ , containing 0.003% PTU (phenylthio-carbamide, Sigma; St. Louis, MO). PTU can be prepared as a 10x solution by dissolving 0.3-g PTU in 1 L of E3 embryo media. Solutions containing PTU should be protected from light by covering with aluminum foil.
11. 12-channel pipettes, 2-20 μL (Eppendorf).
12. 12-channel pipettes, 3-300 μL (Eppendorf).
13. Disposable polystyrene pipette basin, 50 mL (Fisher Scientific).
14. Small molecule library of structurally diverse compounds arrayed in a 96-wll format at 10 mM stock in DMSO. Each master plate is aliquoted into 96-well polypropylene storage plates (Corning), and stored at -80°C until use.
15. Aluminum sealing tape for 96-well plates (Nunc, Rochester, NY).
16. DMSO (Sigma, St. Louis, MO).
17. Basic incubator, 28.5°C (Fisher Scientific).
18. Stereomicroscope with transmitted light base (Leica Microsystems, Bannockburn, IL).