Profilering av metyltransferaser och andra S-Adenosyl- _L-Homocystein-bindande proteiner av Capture Compound masspektrometri (CCMS)

Summary

Fånga Föreningar är trifunctional små molekyler för att minska komplexiteten i de proteomet av funktionella reversibel liten molekyl-protein växelverkan följt av foto-crosslinking och rening. Här använder vi ett Capture förening med

Abstract

Det finns en rad olika modeller för att minska komplexiteten i de proteomet på grundval av funktionella liten molekyl-protein interaktioner som t.ex. affinitetskromatografi ¹ eller Activity Based Protein profilering ^2. Trifunctional Capture föreningar (CCS, Figur 1A) ³ är grunden för en generisk metod, där den initiala jämvikten driven samverkan mellan en liten molekyl sond (selektivitet funktionen, här _{S-adenosyl-L-homocystein,} SAH, Figur 1A) och målproteiner är oåterkalleligen fast på foto-crosslinking mellan en oberoende foto-aktiverbara reaktivitet funktion (här en phenylazide) av CC och ytan av målproteiner. Sorteringen funktion (här biotin) tjänar till att isolera CC - protein konjugat från komplexa biologiska blandningar med hjälp av en fast fas (här streptavidin magnetiska kulor). Två konfigurationer av experiment är möjliga: "off-pärla" ⁴ eller nu beskrivna "on-kula" konfiguration (Figur 1B). Selektiviteten funktion kan praktiskt taget alla liten molekyl av intresse (substrat, hämmare, läkemedelsmolekyler).

_{S-adenosyl-L-metionin} (SAM, Figur 1A) är förmodligen andra till ATP, den mest använda kofaktor i naturen ^{5, 6.} Det används som den största metylgruppsdonator i alla levande organismer med den kemiska reaktionen som katalyseras av SAM-beroende metyltransferaser (MTases), som metanollösning ^DNA-7, RNA ^{8, 9} proteiner eller små molekyler ^10. Med tanke på den avgörande roll som metylering reaktioner i olika fysiologiska scenarier (genreglering, epigenetik, metabolism), kan profilering av MTases förväntas bli av lika stor betydelse i funktionell proteomik som profilering av kinaser. Analytiska verktyg för profilering, dock inte varit tillgängliga. Vi införde nyligen en CC med SAH som selektivitet grupp för att fylla detta teknologiska gapet (Figur 1A).

SAH, produkten av SAM efter metyl överföring, är en känd allmän MTase produkt hämmare ^11. Av denna anledning och eftersom den naturliga kofaktor SAM används av ytterligare enzymer överföra andra delar av kofaktor eller initiera radikala reaktioner samt på grund av dess kemiska instabilitet ^12, är SAH en idealisk selektivitet funktion för en CC att rikta MTases. Här rapporterar vi nyttan av SAH-CC och CCMS genom att profilera MTases och andra SAH-bindande proteiner från stam DH5α av Escherichia coli (E. coli), en av de bästa karaktäriseras-prokaryoter, som har fungerat som den föredragna modellen organism i otaliga biokemiska, biologiska och biotekniska studier. Foto-aktiverade crosslinking förbättrar avkastningen och känsligheten i experimentet, och specificiteten kan lätt testas för i konkurrens experiment med ett överskott av fria SAH.

Protocol

1) Beredning av E. coli DH5α Cell lysat

1. Inokulera en 2ml kultur (LB media i ett provrör) med E. coli DH5α stam direkt från en glycerol lager och inkubera vid 37 ° C och 250 rpm för 8 h. Använd autoklaveras LB media (10 g / l Bacto-trypton, 5 g / L jästextrakt, 10 g / L NaCl, pH 7,5).
2. Inokulera 250 medier ml LB i en 1 L shaker kolven med bafflar med 2 mL kultur och inkubera över natten vid 37 ° C och 166 rpm i en inkubator med skakapparat.
3. Inokulera fyra 5 L shaker kolvar med bafflar som båda innehåller 2,5 media L LB med 250 ml kultur (50 ml per flaska) och inkubera kulturer vid 37 ° C och 166 rpm tills en OD ₆₀₀ på 0,8 uppnås.
4. Harvest cellerna genom centrifugering vid 4 ° C, 3000x gi 20 min. Utför vidare hantering vid 0-4 ° C eller på is.
5. Återuppslamma skördade cellen materialet i Milli-Q Water, kombinera i en centrifug hink och centrifugera i ytterligare 30 min vid 6000x g och 4 ° C.
6. Förvara den resulterande 20 materialet g cell vid -20 ° C eller -78 ° C.
7. Återsuspendera cellerna i 100 ml iskall cell öppning buffert (6,7 mM MES, 6,7 mm NaOAc, 6,7 mm HEPES, 1 mM EDTA, 10 mm β-merkaptoetanol, 200 mM NaCl, pH 7,5, 10% (w / v) glycerol, 0,2 mM PMSF) och Sonikera tre gånger under 1 minut i fyra 25 ml på is med hjälp av en sonifier (t.ex. SONOPULS HD 2070 från BANDELIN elektroniska GmbH & Co KG, maximal amplitud, kontinuerlig utgång).
8. Centrifugera lysat över natten på 2370x g och 2 ° C.
9. Koncentrera supernatanten till 14 ml genom ultrafiltrering (t.ex. med iCON koncentratorer, 7 mL/9K, från Pierce) på 2370x g och 2 ° C.
10. Bryter trögflytande koncentrat från små molekyler som Sam eller SAH genom gelfiltrering vid 2 ° C (t.ex. Zeba AVSALTA Spin Columns, 10 ml, från Pierce, fyra kolumner, lagring buffert bort vid 1000x gi 2 minuter, fyra gånger jämvikt med 5 ml iskall cell öppning buffert och buffert bort vid 1000x gi 2 minuter, respektive 3,5 ml koncentrat tillämpas på varje kolumn, 45 min centrifugering vid 24x g, sedan två gånger 2 min vid 1000x g)
11. Tillägg den resulterande 13 ml lysat med 13 ml iskall glycerol och Roche mini-proteashämmare tabletter cocktail, EDTA gratis. Blanda och lös upp tabletterna.
12. Förvara lysat vid -20 ° C
13. Bestäm den totala proteinkoncentration av Bradford-analysen (21 mg / ml i detta fall). Bradford reagens: 100 mg Coomassie Brilliant Blue G-250 i 50 ml 95% etanol, tillsätt 100 ml 85% (w / v) fosforsyra, späd till 1 liter när färgen helt har lösts upp och filtrera genom Whatman # 1 papper bara före användning.

2) Capture analys (A), konkurrens Control (C), Pulldown (PD), konkurrens Kontroll av Pulldown (CPD) och kombinerad Capture-analys plus Pulldown (A + PD)

1. För att fånga experimenten var SAH caproKit (caprotec bioanalytics GmbH) som används, vilket inkluderar SAH-CC, fri SAH som konkurrent, streptavidin-belagd magnetiska pärlor med 1 mm diameter (Dynabeads MyOne Streptavidin C1, Invitrogen Dynal), 5X fånga buffert (5X CB, innehållande 100 mM HEPES, 250 mm kaliumacetat, 50 mm magnesium acetat och 50% glycerol) och 5X tvättbuffert (5X WB, innehållande 250 mM Tris HCl, pH 7,5, 5 mM EDTA, 5 M NaCl, 42,5 mikroM _{oktyl-β-D-glukopyranosid).}
2. För flera parallella experiment är det rekommenderat att förbereda en mästare blandning av vatten, fånga buffert och E. coli lysat och att utföra reaktioner inom olika rör med en 200 mikroliter-PCR rör band (rekommenderas 0,2 ml Thermo-Strip, Thermo Scientific, AB-1114). Här finns mängder för ett reaktionsrör ges. Resultat för fem olika experiment kommer att presenteras, som fångar analys (A), konkurrens kontroll (C), pulldown (PD), konkurrens kontroll över pulldown (CPD) och kombinerad fånga analys plus pulldown (A + PD).
3. För varje reaktion, förbereda 1,5 ml 1X WB genom att tillsätta 0,3 mL 5X WB till 1,2 ml Milli-Q Water.
4. Förbered SAH-CC laddad streptavidin-belagd magnetiska kulor (caproBeads) i 200 mikroliter PCR-röret remsor. Därför, blanda 25 mikroliter av 100 mikroM SAH-CC med 50 mikroliter av 10 mg / ml streptavidin-belagd magnetiska kulor för varje delprov, Skaka den resulterande indragningar i rumstemperatur i 2 min för att bindningen av biotin fraktionen av SAH- CC till streptavidin på den magnetiska pärla ytan och samla pärlor med hjälp av en stark magnet (t ex i mössor av PCR-röret remsorna med caproMagTM magnetisk enhet, caprotec bioanalytics GmbH). Kasta supernatanterna, återsuspendera den resulterande caproBeads i 200 mikroliter WB, magnetiskt samla caproBeads (i mössor av PCR-röret remsor), och kassera supernating WB. Nära rören för att undvika uttorkning av pärlor.
5. Förbered alikvoter av E. coli DH5α helacell lysat i nya PCR-rör vid 0-4 ° C med en Master Mix (se 2.2). För en reaktion, komplettera en volym på Milli-Q vatten till en slutlig reaktionsblandning volym av 100 mikroliter med 20 mikroliter 5X CB. Blanda, lägg till 0,26 mg E. coli lysat, och blanda försiktigt genom inversion. Endast för C och CPD, tillsätt 20 mikroliter 10 mM SAH konkurrent lösning och blanda försiktigt genom inversion (lägg Milli-Q vatten istället för SAH lösningen på ett, PD, och A + PD). Rita en 1 mikroliter prov från A för vidare analys (se nedan).
6. Häng caproBeads i respektive lysat och inkubera i 3 timmar vid 4 ° C håller pärlorna i suspension genom rotation för att reversibel bindning av SAH proteiner till SAH selektivitet funktion av SAH-CC.
7. Placera suspensioner A, C och A + PD i caproBoxTM (enheten för bestråla biokemiska prover med UV-ljus och samtidigt kyla, caprotec bioanalytics GmbH) och bestråla en total tid på 30 min i det slutna rör mellan 0-4 ° C att bilda ett kovalent Crosslink mellan reaktivitet funktion av SAH-CC till SAH proteiner. Därför, ta bort suspensioner efter bestrålning intervaller på 2,5 minuter respektive från caproBoxTM, låt svalna i isvatten för ~ 15 s (speciellt lock), blanda flera gånger av inversion, inom kort (~ 2 s) centrifug för att upphävandet återstående i lock, och sätt tillbaka in i caproBoxTM för nästa bestrålning intervall.
8. Tillsätt 20 mikroliter 10 mM SAH lösning till A, eller 20 mikroliter Milli-Q Water till C, PD, CPD, och A + PD och inkubera suspension 10 minuter vid 4 ° C för att tränga undan, i A, SAH bindande proteiner inte tvärbunden till SAH-CC. Förvara kulorna i suspension genom rotation eller intermittent manuellt resuspension.
9. Samla caproBeads från befrielsen, med en stark magnet (t.ex. caproMagTM), kassera supernatanterna och tvätta kulorna sex gånger - genom resuspension och insamling - med 200 mikroliter 1X WB och en gång med 200 mikroliter Milli-Q Water.
10. Kulorna kan lagras i Milli-Q vatten i flera veckor vid 4 ° C. Alternativa protokoll för vidare bearbetning av den fångade proteiner och deras identifiering (se diskussion).
11. Tvätta pärlor tre gånger med 200 mikroliter 60% acetonitril (ACN) och släpp den tagna proteiner från pärlor efter 10 minuter inkubation vid rumstemperatur under kraftig omskakning med 200 mikroliter 60% ACN/0.2% trifluorättiksyra (TFA) (förbereda färsk) . Använd LC-MS-grade reagenser och vatten.
12. Magnetiskt samla pärlor, separera och indunsta supernatanten till torrhet med hjälp av en centrifugal förångare (t.ex. MIVAC DNA koncentrator från GeneVac, Inc., Storbritannien). Kasta pärlor.

3) SDS-PAGE av Fångad Proteiner

1. För SDS-PAGE, lös upp den fångade proteiner frigörs från magnetiska kulor (avdunstat ACN / TFA-lösningar från steg 2,12) i 20 mikroliter SDS prov buffert (50 mM Tris HCl, 320 mm β-merkaptoetanol, 2,5% SDS, 0,05% Bromfenolblått , 10% glycerol, pH 6,8). Blanda 1 mikroliter urval som dras från A (se steg 2,5) med 19 mikroliter SDS prov buffert, användning 5 mikroliter av denna lösning för SDS-PAGE analys (0,25% av test). Värm prover i SDS prov buffert 10 min till 95 ° C och låt låt svalna till rumstemperatur.
2. Analysera med SDS-PAGE (allmänna inställning: OLS ® ProPage 4-20% Tris / glycin prefabricerade geléer, OLS OmniPage mini gelelektrofores systemet, SDS löpande buffert: 25 mM Tris bas, 200 mm glycin, 0,1% SDS, pH 8,3 , körtid 90 min vid en konstant spänning på 180 V under isen kylning av SDS löpande buffert).
3. Silver färga gelen med hjälp av en MS-kompatibel silver bets metod (t.ex. ProteoSilver Silver Stain Kit från Sigma). En representant Resultatet visas i figur 2.

4) I-gel Tryptic Digest av proteiner och Peptide Utsug från Gel Band

1. Tvätta silver färgade gelen minst tre gånger med 100 ml Milli-Q vatten i 10 min efter det silver fläcken helhetslösning togs bort.
2. Klipp ut gelen band (t.ex. med hjälp av en ren skalpell och överför till ett 0,5 ml Eppendorf-rör) och förvara vid -20 ° C eller direkt process. Tvätta gelen banden i 15 min respektive med 100 mikroliter vatten, 100 mikroliter 50% etanol, 100 mikroliter vatten, 100 mikroliter 50% etanol, och för 5 min med ren etanol. Upprepa tvättningen ytterligare en gång.
3. Återfukta gelen bandet med 10 mikroliter i-gel digestion lösning (12,5 ng / mikroliter sekvensering årskurs trypsin i 50 mm ammoniumbikarbonat, förbereda genom att tillsätta 7,5 mikroliter 0,5 mikrogram / mikroliter trypsin lösning i 1 mM HCl till 292,5 mikroliter 50 mM ammoniumbikarbonat ) under 45 minuter vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och ersätt med 20 mikroliter 50 mM ammoniumbikarbonat (utan trypsin) följt av inkubering vid 37 ° C över natten under omskakning.
4. Samla supernatanten. För peptid utvinning, inkubera gelen bandet med 20 mikroliter 5% myrsyra (FA) i 15 minuter under omskakning lägga20 mikroliter ACN och inkuberas i ytterligare 15 minuter under omskakning. Kombinera supernatanten med föregående supernatanten och upprepa peptiden extraktionsförfarande igen.
5. Indunsta de kombinerade tre supernatanterna till torrhet, lös upp i 10 mikroliter 5% FA under omskakning och tillämpa ultraljud (ultraljudsbad, t.ex. Sonorex från Bandelin, Tyskland) och fortsätter med avsaltning (steg 5,2 och vidare).

5) Tryptic Digest av tillfångatagna Proteiner och Beredning av peptider för LC-MS/MS

1. Lös den tagna proteiner frigörs från magnetiska kulor (avdunstat ACN / TFA-lösningar från steg 2,12) i 10 mikroliter 50 mM ammoniumbikarbonat med ett ultraljudsbad vortexa, tillsätt 1 mikroliter 0,5 mikrogram / mikroliter trypsin i 1 mM HCl och inkubera lösningen på 37 ° C över natten.
2. AVSALTA lösningen innehåller Tryptic peptider av de tagna proteiner med hjälp av C18 material (t ex 2-10 mikroliter StageTips, 20 mikroliter spets, Proxeon Biosystems A / S, Odense, Danmark, tillverkarens förfarande: förutsättning med 10 mikroliter 50% metanol / 5 % FA, jämvikt med 10 mikroliter 5% FA, ladda med peptider tillfångatagna proteiner, tvätta med 10 mikroliter 5% FA, eluera två gånger med 10 mikroliter 50% metanol / 5% FA).
3. Förånga desalted peptider i 50% metanol / 5% FA till torrhet, lös upp i 5,5 mikroliter 0,1% FA under omskakning och använda ultraljud (ultraljud bad) och analysera provet genom nanoLC-MS/MS.

6) NanoLC-MS/MS Analys

1. Överför provet till exempel plåt och placera plattan i nano-flödet vätskekromatografi (nanoLC) systemet (t.ex. Easy-NLC Vätskekromatografisystem; Proxeon Biosystems A / S, Danmark).
2. Använd 0,1% FA i vatten som rörlig fas A och 0,1% FA i ACN som rörlig fas B. Använd endast LC-MS klass lösningsmedel.
3. Belastning 5 mikroliter av peptiden lösningen direkt på en pre-kolumn (t.ex. nanoflow Biosphere C18, 5 ìm, 120 A, 20 x 0,1 mm, NanoSeparations, Nederländerna) kopplad till en analytisk kolonn (t.ex. nanoflow Biosphere C18, 5 ìm, 120 A , 100 x 0,075 mm, NanoSeparations, Nederländerna) med 5% ACN/0.1% FA.
4. Under LC, eluera peptider under en 80 min linjär övertoning från 5% ACN/0.1% FA till 40% ACN/0.1% FA följt av ytterligare 2 min till 100% ACN/0.1% FA och kvar på 100% ACN/0.1% FA i ytterligare 8 min med ett kontrollerat flöde på 400 Nl / min.
5. Utför masspektrometrisk (MS) analys av elueras peptider på en hög noggrannhet state-of-the-art masspektrometer (t.ex. LTQ Orbitrap XL masspektrometer, Thermo FisherScientific, Tyskland, utrustad med en nanoelectrospray jonkälla för elektrospray jonisation (ESI), Proxeon Biosystems A / S, Danmark).
6. Utför masspektrometrisk analysen i data-beroende läge för att automatiskt växla mellan orbitrap-MS (profil-läge) och LTQ-MS/MS (centroiden läge) förvärvet.
7. Styr massa cykel spektrometer plikt genom att injektionen tiden Automatic Gain Control.
8. Förvärva undersökning fullständig genomsökning MS spektra (från m / z 300 till 2000) i orbitrap med upplösning r = 60 tusen på m / z 400 (efter ackumulering till ett målvärde på 500.000 avgifter i den linjära jonfälla).
9. Ställ in instrumentet till sekventiellt isolera de mest intensiva joner (upp till fem, beroende på signalstyrka) för fragmentering i den linjära jonfälla med kollision-induced dissociation (CID) vid ett målvärde på 10.000 avgifter. Den resulterande fragment joner registreras i LTQ.
10. För noggrann massa mätningar i MS-läge, använd enstaka laddade polydimethylcyclosiloxane bakgrund jon (Si (CH _{3) 2} O) ₆ H ⁺ (m / z 445,120025) som alstras under elektrospray processen från luften låset massan i realtid interna omkalibrering.
11. Dynamiskt utesluta mål joner redan mass-ut för CID under hela 60 s.
12. Ställ screening laddningstillstånd och förkastande av joner för CID med lediga laddning.
13. Ytterligare masspektrometrisk inställningarna är följande: ställ spraya spänningen till 1,6 kV, ställ temperaturen på den uppvärmda överföringen kapillär till 200 ° C, och normaliserade kollision energi är 35% för MS ^2. Den minimala signal som krävs för MS ² är 500 räknas. Applicera en aktivering q = 0,25 och en aktivering på 30 ms för MS ² förvärv.
14. För att rengöra LC system, en tom köra mellan två på varandra följande CCMS mätningar.

7) peptid-och proteinidentifiering via automatiserad Sequence Database Search

1. Använd en algoritm proteinidentifiering att analysera MS / MS-data (i detta fall lagras i RAW-filer), t.ex. SEQUEST genomföras i BioworksBrowser 3.3.1 SP1 (Thermo FisherScientific, Tyskland) och X! Tandem (Global Proteome Machine Organisation, version 2007.01.01.1) genomförs i Scaffold 3 (version Scaffold_3_00_03, Proteome Software Inc., USA).
2. Utför automatisk databassökning mot den senaste UniProtKB / Schweiz-Prot databas släpper www.expasy.org av organismen undersökta (databas som används för denna studie: Escherichia coli, stam K12, släpp 57-11).
3. Använd följande inställningar för automatisk sökning i databaser inom SEQUEST: 5 ppm föregångare tolerans, en AMU fragment jon tolerans, och full trypsin specificitet tillåter upp till två missade klyftor. Tillåt som variabel ändringar fosforyleringen på serin, treonin och tyrosin, oxidation av methionines, deamidation på asparagin och glutamin, acetylering på lysin och serin, formylation på lysin, och metylering på arginin, lysin, serin, treonin och asparagin. Använd inte fast ändringar i databasen sökningen.
4. Ladda SRF eller DTA och ut filer som genereras av SEQUEST till schavotten 3, som utför sannolikhetsbedömning av peptid uppdrag och identifikationer protein genom att kombinera SEQUEST och X! Tandem sökningar databas. Scaffold är användbart för att enkelt jämföra och visualisera protein listor från flera prover (i detta fall A, C, PD, CPD, och A + PD).
5. Ställ in parametrarna i ställningen 3 programvara för att enbart beakta peptider med ≥ 95% sannolikhet som anges av peptiden Profeten algoritm (ref.13). Ställ sannolikheter proteinidentifiering för flera peptid uppdrag till ≥ 95% enligt Protein profeten algoritmen ^13. För enskilda identifieringar peptid protein, godtyckligt ställa protein sannolikheten till ≥ 50% och manuellt inspektera motsvarande peptiden MS / MS spektra. Proteiner som består av liknande peptider och kunde inte differentieras baserat på MS / MS-analys enbart är grupperade efter programvaran för att fråga uppfyller principerna om sparsamhet. Den uppskattade falska upptäckten hastighet av peptid identifikationer kan bestämmas med hjälp av omvända synsätt protein databas och ska vara <1%.
6. Representativa resultat av CCMS experiment finns i tabellerna 1, 2 och Kompletterande tabell S1 (ihåg att proteinet databasen inte up-to-date för vissa proteiner, t.ex. PrmB (alias YfcB) eller RSMH (aka MraW)), samt enligt figur 3.

8) representativa resultat

Tabell 1:

Protein	ORF	MW / kDa	Beskrivning	Substrat	En	C	PD	CPD	A + PD
DCM	b1961	53,5	DNA-cytosin MTase	DNA (m5C)	1	0	0	0	1
RlmI	b0967	44,4	23S rRNA m5C1962 MTase	rRNA (m5C)	17	0	17	0	20
RlmL	b0948	78,9	23S rRNA m2G2445 MTase	rRNA (m2G)	12	0	0	0	10
TrmB	b2960	27,3	tRNA (guanin-N (7) -)-MTase	tRNA (m7G)	11	0	0	0	13
CmoA	b1870	27,8	tRNA (cmo5U34)-MTase	tRNA (mcmo5U)	7	0	0	0	4
RsmG	b3740	23,4	16S rRNA m7G MTase	rRNA (m7G)	6	0	1	0	5
RSMH	b0082	34,9	16S rRNA m4C1402 MTase	rRNA (m4C)	5	0	0	0	7
RsmD	b3465	21,7	16S rRNA m2G966 MTase	rRNA (m2G)	2	0	0	0	2
RsmB	b3289	48,3	16S rRNA m5C967 MTase	rRNA (m5C)	1	0	0	0	0
MnmC	b2324	74,4	Bifunktionell protein innehåller tRNA (MIM (5) S (2) U34)-MTase	tRNA (mnm5s2U)	1	0	0	0	0
PrmB	b2330	35,0	50S ribosomala proteinet L3 Gln150 MTase	protein (GLN)	13	0	0	0	15
Cher	b1884	32,8	Chemotaxis protein MTase	protein (GLU)	0	0	0	0	1
CFA	b1661	44,9	Cyklopropan-feta-acyl-fosfolipid-syntas	småmolekylära	15	0	0	0	14
Tam	b1519	29,0	Trans-aconitate 2-MTase	småmolekylära	2	0	0	0	3
CysG	b3368	50,0	Siroheme syntas innehåller uroporphyrinogen-III C-MTase	småmolekylära	1	0	0	0	2
SMTA	b0921	29,8	Protein SMTA	(? En)	7	1	0	0	8
MtnN	b0159	24,4	5'-Methylthioadenosine / SAH nucleosidase	småmolekylära B	36	0	0	0	39
GlnA	b3870	51,9	Glutaminsyntetas	småmolekylära C	90	0	0	0	97
RplK	b3983	14,9	50S ribosomala proteinet L11	av protein MTase PrmA d	2	0	0	0	2

^en inte (helt) karakteriseras

^b Nej metylering men klyvning av glykosidbindning av SAH

^c Nej metylering men bindande för SAH i ATP-bindningsstället vilket framgår av CCMS experiment med ATP som konkurrent (data visas inte)

^d substrat 50S ribosomala proteinet L11 MTase PrmA, reproducerbar specifik identifiering av CCMS (data visas inte)

Tabell 1: MTases och andra utvalda proteiner identifieras av CCMS experiment. De angivna siffrorna anger ovägda peptiden spektrala greve Per protein. Prover är dubbletter av dessa analyseras av SDS-PAGE/silver fläcken i figur 2. Mycket mer MTases och andra SAH bindande proteiner är identifierade i CCMS analys (A) jämfört med rullgardinsmenyn (PD) och SAH specificitet visas av den nästan totala avsaknaden av dessa proteiner i tävlingen kontroll (C).

Tabell 2:

	En	C	PD	CPD	A + PD
En	111 (64)
C	65 (41)	107 (46)
PD	25 (15)	23 (13)	61 (17)
CPD	23 (13)	22 (12)	20 (14)	47 (14)
A + PD	87 (61)	64 (41)	23 (14)	22 (12)	124 (67)

Tabell 2: Totalt antal identifierade proteiner i CCMS springer och överlappning protein mellan körningar. Antalet proteiner identifieras med minst 2 peptider anges inom parentes. Den höga metodens reproducerbarhet kan härledas från hög proteinhalt överlappning (av främst ospecifika proteiner) mellan jämförbara experiment (A mot C och särskilt A mot A + PD men också PD vs CPD) särskilt med proteiner robust identifieras med minst 2 peptider. Se även figur 3 för Venn diagram och kompletterande S1 tabell finns en lista över alla identifierade proteiner.

Figur 1a: Kemisk struktur trifunctional Capture Compound (CC). Selektiviteten funktion är inramat med en droppe, reaktiviteten funktion med en stjärna och sortering funktion med en halvmåne. Den kemiskt stabil _{S-adenosyl-L-homocystein} (SAH) är kofaktor produkt av _{S-adenosyl-L-metionin} (SAM) efter metylgrupp överföringen genom SAM-beroende MTases, som SAH fungerar som en produkt-hämmare.

Figur 1b: CCMS "on-pärla "arbetsflöde. CC är bunden på magnetiska kulor av dess sortering funktion (en), är det så bildas caproBeads inkuberas med den komplexa proteinblandningens (b), där en reversibel bindning jämvikt (c) är etablerat mellan selektivitet funktion CC och de proteiner som mål. Vid UV-bestrålning (d), bildar reaktivitet funktionen en kovalent Crosslink. Efter tvättning av magnetiska kulor som bär fångade proteiner (e), klyvning av tvärbunden CC-protein komplex från magnetiska kulor (f) och Tryptic smälta (g), kan den tagna proteiner identifieras med MS-analys av Tryptic peptider.

Figur 2: SDS-PAGE/silver fläck analys av fångade proteiner (efter steg f i figur 1B). Körfältet beskrivning ges på toppen av gelen (MW: molekylviktsmarkör med motsvarande molekylvikt av markören banden ges till mycket höger, L: 0,25% prov tas från E. coli DH5a helcells lysat innan du lägger till caproBeads i steg b i figur 1B, A: assay med tillsats av ett överskott av fria SAH efter UV-strålning steg d i figur 1B, C: kontroll av analysen inklusive ett överskott av fria SAH som konkurrent under steg c och d i figur 1B (väsentliga att fastställa eventuella ospecifikt fångas proteiner), PD: pulldown mening ingen UV-strålning steg d i figur 1B och inga tillägg av fria SAH, byggproduktdirektivet: kontroll av pulldown med SAH som konkurrent, A + PD: kombinerad analys plus pulldown mening inget utöver fria SAH under arbetsflödet). Proteiner identifieras med MS från utskurna protein gel band efter att i-gel Tryptic smälta ges till mycket leftt. Det är uppenbart att foto-crosslinking ökar avkastning och känsligheten i experimentet, och specificiteten kan lätt testas för i konkurrens experiment med ett överskott av fria SAH. Se tabell 1 för MTases och andra utvalda proteiner identifieras av CCMS experiment av dubbla prover av de som visas i denna figur.

Figur 3: Venndiagram explaning överlappningen av identifierade proteiner i CCMS analys (A), konkurrens kontroll (C) och pulldown (PD). Vänster: Antal MTases och SAH nucleosidase, endast med hänvisning till tabell 1. Höger: Antal alla identifierade proteiner enligt Tabell 2 och kompletterande S1 tabell. Antalet proteiner identifieras med minst 2 peptider anges inom parentes.

Discussion

Följande försiktighetsåtgärder och kommentarer kan vara användbart när man följer den beskrivna protokoll: a) En stor fördel av CCS ligger i bildandet av en kovalent bindning mellan CC och MTase, eftersom detta tillåter efterföljande stränga tvätt förhållanden. Den kovalenta Crosslink uppnås genom en photoreaction utlöses av UV-ljus (310 nm max.). Normal överljus innehåller endast en liten del av UV dock skydda SAH-CC från längre exponering för overhead eller ens solljus upp till den kontrollerade och kyls bestrålning i caproBox. b) biologiska prover från vilken MTases ska isoleras kan innehålla proteiner benägen att denaturering, därför är det obligatoriskt att hålla proverna svalt och för att undvika skumbildning vid alla tillfällen. c) caproBox kyler proverna till 0-4 ° C, lamporna avger UV-ljus, men också avger värme. Därför är det nödvändigt att kort centrifugera ampullerna före bestrålning, så proteiner som ansluter sig till Caps eller väggar flaskan kan inte bilda nederbörd frön. d) Om resuspension av magnetiska kulor (t.ex. i tvätt-lösningar) är inte möjligt för hand, inom kort ansöka ultraljud genom att placera prover i ett ultraljudsbad. e) Färskt förbereda 0,2% TFA/60% ACN lösning. Vi fann att annars fångade proteiner inte kan klyvas från pärlor. f) Den slutliga analysen av tillfångatagna proteiner utförs av LC-MS/MS. Masspektrometri är en mycket känslig metod. Det är nödvändigt att använda uteslutande LC-MS-grade reagenser i de sista stegen (steg 2,11 och vidare). Undvika kontaminering av experiment av externa proteinkällor, t.ex. keratin härrör från damm eller från försöksledaren. Särskilt under de sista matsmältningen stegen, rekommenderas att uppmärksamma en ren arbetsplats, att bära handskar och en skyddsrock och eventuellt ett hårnät eller helst utför de sista stegen i en ren bänk. Förbered 50 mM buffert ammoniumbikarbonat används för Tryptic smälta i LC MS årskurs vatten, filtrera genom 0,22 ìm filter, delprov, lagra vid -20 ° C, och använda varje alikvot endast en gång för att undvika föroreningar. Den trypsin lösningen (sekvensering grad, Roche, förbereda en 0,5 mikrogram / l lösning genom att tillsätta 1 mM HCl till frystorkad trypsin) kan lagras vid 4 ° C i flera veckor. g) För att få tillförlitlig masspektra är det viktigt att ha en stabil spray i ESI-MS/MS analys. h) För andra LC-MS/MS system än den som användes i denna studie, måste mätparametrar och peptid algoritmer identifiering justeras individuellt.

Följande ändringar är möjliga med hänsyn till den beskrivna protokollet: a) Alternativt att släppa proteiner från kulorna med 60% ACN/0.2% TFA (steg 2,11), kan de proteiner direkt tryptically rötas i en pärla suspension (samma volymer som i steg 5.1) eller, för SDS-PAGE, kan de proteiner frigöras genom att avbryta och värme kulorna samlas efter steg från 2,9 till 95 ° C i 10 min i SDS prov buffert (båda, hela avstängning eller bara supernatanten kan lastas in gelen fickan). Vi fann att kulorna sakta släppa små mängder av polymer i vattenlösning Tryptic smälta lösning under on-pärla Tryptic smälta även efter flera vattenlösning tvätt steg. Polymeren föroreningar stör MS peptid identifiering och kan tvättas bort kulorna med 80% ACN (minst tre gånger). Efter 80% steg ACN tvätta, bör pärlorna tvättas en gång med vatten före på pärla Tryptic smälta. b) Western blotting med streptavidin-horseraddish peroxidas och ECL-substrat kan också användas för att visualisera framgångsrika crosslinking av biotin innehåller CC till proteiner. Därför antingen gel som erhålls efter steg 3,2 kan utplånas, eller, eftersom känsligheten är ca 10 gånger högre än silver färgning av geler, får 10 ìl prover efter steg 2,7 också analyseras med Western blot. Ihåg att i det senare fallet endogeneously biotinylerad proteiner också kan upptäckas förutom proteiner artificiellt biotinylerad av SAH-CC. c) Vi fann att det beror på det särskilda systemet (lysat, riktat målproteiner, selektivitet och reaktivitet funktion han CC), om "off-pärla" konfiguration, där crosslinking reaktionen sker mellan fria CC och protein i lösning ⁴ eller för närvarande beskrivs "on-kula" konfiguration (Figur 1B) presterar bättre.

I allmänhet bör metoden även kompatibel med alla state-of-the art stabila isotopen protein eller peptid märkning teknik, eller bedömning av den fånga provet genom 2D gelelektrofores. I "off-pärla" konfiguration, är det också möjligt att fånga proteiner inom hela celler (opublicerade resultat). Dessutom kan läkemedel eller kofaktor bindande platsen av ett protein att anges genom att bestämma den närbelägna crosslinking positionen för CC inom proteinsekvens av MS peptid sekvensering. Bindningen läge för en liten molekyl till ett protein som kan utforskas med hjälp av olika chemical fastsättning befattningar på selektivitet funktion och olika länkare längder. Som visas i den aktuella studien, tog även proteinbindning partner i de proteiner som selektivitet funktion (RplK som substrat för PrmA) eller okänd liten molekyl interaktioner protein (SAH till GlnA) kan identifieras. Sammanfattas, ytterligare inslag av CCS, foto-crosslinking reaktivitet, möjliggör isolering och identifiering av låg rikligt proteiner eller funktionella familjer protein från komplexa protein blandningar med hög känslighet och ger forskare med ytterligare ett verktyg för att studera små molekyler - protein interaktioner .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SAH caproKit™	caprotec bioanalytics GmbH	1-1010-050 (50 reactions) 1-1010-010 (10 reactions)	Includes the SAH-CC, SAH competitor, streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and wash buffer
caproBox™	caprotec bioanalytics GmbH	1-5010-003 (110 V) 1-5010-004 (230 V)	For reproducible photo-activation while cooling the samples
caproMag™	caprotec bioanalytics GmbH	1-5100-001	For easy handling of magnetic particles without pipetting