Analyse von pluripotenten Stammzellen mit Kryoschnitte von Embryoid Bodies
Summary
Pluripotenten Stammzellen in Suspension wachsende Differenzierung in Embryoidkörpern (EBS). Hier zeigen wir, wie eine hohe Qualität EB Kryoschnitten nützlich für die Untersuchung zellulärer und molekularer Aspekte der Embryogenese zu erhalten, unter Wahrung ihrer Organisation als Aggregate.
Abstract
Embryonale Stammzellen (ES-Zellen) sind pluripotente Zellen aus der inneren Zellmasse der Blastozyste-Phase Anfang Säugerembryonen 1 abgeleitet. Eine entscheidende Etappe in der Differenzierung von ES-Zellen ist die Bildung von Embryoidkörpern (EVG) Aggregate 2, 3. EB Bildung ist auf spontane Aggregation basiert, wenn ES-Zellen in nicht haftenden Platten kultiviert. Ektoderm, Mesoderm und Endoderm 4: Dreidimensionale EB rekapituliert viele Aspekte der frühen Embryogenese von Säugetieren und in die drei Keimblätter differenzieren.
Immunfluoreszenz und in situ-Hybridisierung sind allgemein Techniken für die Detektion von Target-Proteinen und mRNA in Zellen eines Gewebes § 5, 6, 7 verwendet. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache Technik, um qualitativ hochwertige Gefrierschnitte von Embryoidkörpern generieren. Dieser Ansatz stützt sich auf die räumliche Orientierung der EB Einbettung in OCT gefolgt von den Gefrier-Technik. Die daraus resultierenden Abschnitte können auf eine Vielzahl von analytischen Verfahren unterzogen werden, um Populationen von Zellen, die bestimmte Proteine, RNA oder DNA zu charakterisieren. In diesem Sinne sind die Herstellung von EB Kryoschnitten (10 um) wesentliche Instrumente für die Histologie Färbung Analyse (zB Hämatoxilin und Eosin, DAPI), Immunfluoreszenz (zB Oct4, Nestin) oder in-situ-Hybridisierung. Diese Technik kann auch dazu beitragen, Aspekte der Embryogenese in Bezug auf die Aufrechterhaltung des dreidimensionalen sphärischen Struktur des EBs zu verstehen.
Protocol
Discussion
Die hier beschriebene Methode bietet eine einfach zu folgen Protokoll PFA fixiert dünne Kryostatschnitte von Embryoidkörpern nützlich für Immunfluoreszenz und in situ-Hybridisierung Assays zu erhalten. Die daraus resultierende Kryoschnitten erlauben die Untersuchung von zellulären und molekularen Aspekten der menschlichen embryonalen Stammzellen die Differenzierung unter Wahrung ihrer Struktur und Organisation als Aggregate.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von Fundação de Amparo unterstützte eine Fortgeschrittenen-do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) und dem Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia (INCTC). Wir sind dankbar, Bruna S. Paulsen und Aline M. Fernandes für die EB Bilder.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| D (+) Sucrose | Reagent | Vetec | 228 | |
| Paraformaldehyde | Reagent | Rieden-de Haën | 16005 | |
| PBS solution | Reagent | LGC Biotecnology | 13-30259.05 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma | P2636 | 200mg/mL in water |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Reagent | Sakura | P2636 | |
| Sucrose Solution | Reagent | 10% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | Reagent | 20% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | Reagent | 30% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Conic Tube | Tool | TPP | 91015 | 15mL conic tube |
| Plate shaker | Tool | Biomixer | ||
| Cryostat | Tool | Leica | CM 1850 | |
| Mold for OCT platform | Tool | Plastic mold plataform |
Referências
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