В естественных условиях и в пробирке исследования Адаптер-клатрин Взаимодействие
Summary
Клатрин эндоцитоза зависит от адаптера белков, которые координируют отбор грузов и клатрин сборки пальто. Здесь мы описываем процедуры для изучения адаптера клатрин физического взаимодействия и живые изображения ячейки подходов, используя в качестве модели дрожжей endocytic Sla1p белка адаптера.
Abstract
Основные endocytic пути инициирует с образованием клатриновых везикулы (CCVS), которые перевозят грузы из клеточной поверхности, чтобы эндосомы 1-6. CCVS отличаются многогранным решетки клатрин, что пальто пузырьков мембраны и служит в качестве механического эшафот. Клатрин пальто собраны во время образования пузырьков из отдельных клатрин triskelia, растворимой формы клатрин состоит из трех тяжелых и три легких цепей субъединиц 7,8. Потому что трискелион не обладают способностью связываться с мембранной напрямую, клатрин-связывающий адаптеры имеют решающее значение для формирования ссылки клатрин решетки мембраны через ассоциацию с липидами и / или мембранных белков 9. Адаптеры также пакет трансмембранный белок грузов, таких как рецепторы, и могут взаимодействовать друг с другом и с другими компонентами образование ССГ техники 9.
Более двадцати клатрин адаптеры были описаны, некоторые из них участвуют в клатрин эндоцитоза и другие локализации в транс Гольджи сеть или эндосомы 9. За исключением HIP1R (дрожжи Sla2p), все известные клатрин адаптеры связываются с N-терминал-рулевых области клатрин тяжелой цепи 9. Клатрин адаптеры являются модульными белки, состоящие из сложенных области, связанные по неструктурированной гибкие линкеры. В рамках этих компоновщик регионах, короткие связывающие мотивы посредником взаимодействий с клатрин N-концевого домена или других компонентов везикул формирование техники 9. Два различных клатрин-связывающие мотивы были определены: клатрин ящик и W-поле 9. Консенсус клатрин коробки последовательность была первоначально определена как L [L / I] [D / E / N] [L / F] [D / E] 10, но варианты были впоследствии обнаружены 11. W-поле соответствует последовательности PWxxW (где х означает каких-либо остатков).
Sla1p (Синтетический Смертельное с актином связывающий белок-1) был первоначально идентифицирован как актин связанных белков и необходим для нормальной структуры цитоскелета актина и динамика на endocytic сайтов в клетках дрожжей 12. Sla1p также связывает NPFxD endocytic сигнал сортировки и имеет решающее значение для эндоцитоза грузов подшипников NPFxD сигнал 13,14. Совсем недавно была продемонстрирована Sla1p связывать клатрин через мотив похож на клатрин окна LLDLQ, называемый вариант клатрин-бокс (VCB), и функционировать как endocytic клатрин адаптера 15. Кроме того, Sla1p стало широко используется маркер endocytic пальто в живой клетки флуоресцентной микроскопии исследования 16. Здесь мы используем Sla1p как модель для описания подходов для адаптера клатрин исследования взаимодействия. Мы ориентируемся на живой микроскопии флуоресценции клетки, GST-кадра, и ко-иммунопреципитации методами.
Protocol
Discussion
Клатриновых везикулы (ССГ) участвовать в эндоцитоза и транспорта из транс-Гольджи сеть и эндосомы, сохраняется путей, которые являются основополагающими для эукариотических клеточной биологии. Подходов, описанных в этой статье методы полезны для изучения молекулярных механизмо?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DF поддерживается NSF Мосты в доктора общения. Микроскоп используется в этой работе при частичной поддержке микроскоп изображений сети основной инфраструктуры грант Университета штата Колорадо. Работа над клатрин адаптеров в лаборатории автора с поддерживается ХСС стартовый капитал и американские награды ассоциации сердца 09SDG2280525 для SD
Materials
| Material | Company |
|---|---|
| QuickChange-XL site-directed mutagenesis kit | Stratagene |
| protease inhibitor cocktail | Sigma |
Referências
- Mellman, I., Warren, G. The road taken: past and future foundations of membrane traffic. Cell. 100, 99-112 (2000).
- Engqvist-Goldstein, A. E., Drubin, D. G. Actin assembly and endocytosis: from yeast to mammals. Annu Rev Cell Dev Biol. 19, 287-332 (2003).
- Conner, S. D., Schmid, S. L. Regulated portals of entry into the cell. Nature. 422, 37-44 (2003).
- Bonifacino, J. S., Traub, L. M. Signals for sorting of transmembrane proteins to endosomes and lysosomes. Annu Rev Biochem. 72, 395-447 (2003).
- Ungewickell, E. J., Hinrichsen, L. Endocytosis: clathrin-mediated membrane budding. Curr Opin Cell Biol. 19, 417-425 (2007).
- Doherty, G. J., McMahon, H. T. Mechanisms of endocytosis. Annu Rev Biochem. 78, 857-902 (2009).
- Kirchhausen, T. Clathrin. Annu Rev Biochem. 69, 699-727 (2000).
- Brodsky, F. M., Chen, C. Y., Knuehl, C., Towler, M. C., Wakeham, D. E. Biological basket weaving: formation and function of clathrin-coated vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 517-568 (2001).
- Owen, D. J., Collins, B. M., Evans, P. R. Adaptors for clathrin coats: structure and function. Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 153-191 (2004).
- Dell’Angelica, E. C., Klumperman, J., Stoorvogel, W., Bonifacino, J. S. Association of the AP-3 adaptor complex with clathrin. Science. 280, 431-434 (1998).
- Dell’Angelica, E. C. Clathrin-binding proteins: got a motif? Join the network!. Trends Cell Biol. 11, 315-318 (2001).
- Holtzman, D. A., Yang, S., Drubin, D. G. Synthetic-lethal interactions identify two novel genes, SLA1 and SLA2, that control membrane cytoskeleton assembly in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Biol. 122, 635-644 (1993).
- Howard, J. P., Hutton, J. L., Olson, J. M., Payne, G. S. Sla1p serves as the targeting signal recognition factor for NPFX(1,2)D-mediated endocytosis. J. Cell. Biol. 157, 315-326 (2002).
- Mahadev, R. K., Pietro, S. M. D. i., Olson, J. M., Piao, H. L., Payne, G. S., Overduin, M. Structure of Sla1p homology domain 1 and interaction with the NPFxD endocytic internalization motif. EMBO J. 26, 1963-1971 (2007).
- Pietro, S. M. D. i., Cascio, D., Feliciano, D., Bowie, J. U., Payne, G. S. Regulation of clathrin adaptor function in endocytosis: A novel role for the SAM domain. EMBO J. 29, 1033-1044 (2010).
- Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A modular design for the clathrin- and actin-mediated endocytosis machinery. Cell. 123, 305-320 (2005).
- Longtine, M. S., McKenzie, A., Demarini, D. J., Shah, N. G., Wach, A., Brachat, A., Philippsen, P., Pringle, J. R. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14, 953-9561 (1998).
- Wach, A., Brachat, A., Alberti-Segui, C., Rebischung, C., Philippsen, P. Heterologous HIS3 marker and GFP reporter modules for PCR-targeting in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 13, 1065-1075 (1997).
- Robinson, J. S., Klionsky, D. J., Banta, L. M., Emr, S. D. Protein sorting in Saccharomyces cerevisiae: isolation of mutants defective in the delivery and processing of multiple vacuolar hydrolases. Mol Cell Biol. 8, 4936-4948 (1988).
- Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J. Bacteriology. 153, 163-168 (1983).
- Vida, T. A., Emr, S. D. A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast. J Cell Biol. 128, 779-792 (1995).
- Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genética. 122, 19-27 (1989).
- Piao, H. L., Machado, I. M., Payne, G. S. NPFXD-mediated endocytosis is required for polarity and function of a yeast cell wall stress sensor. Mol Biol Cell. 18, 57-65 (2007).
