Aislamiento de ratón las células epiteliales respiratorias y la exposición al humo del cigarrillo Experimental de la interfaz de aire líquido
Summary
Células epiteliales pulmonares pueden ser aislados de las vías respiratorias de los ratones y se cultivan en la interfaz aire-líquido como un modelo de epitelio respiratorio diferenciados. Un protocolo es descrito para el aislamiento, el cultivo y la exposición de estas células al humo del cigarrillo convencional, con el fin de estudiar la respuesta molecular a esta toxina ambiental.
Abstract
Células epiteliales pulmonares pueden ser aislados de las vías respiratorias de los ratones y se cultivan en la interfaz aire-líquido (ALI) como un modelo de epitelio respiratorio diferenciados. Un protocolo es descrito para el aislamiento y la exposición de estas células al humo del cigarrillo convencional (SC), con el fin de estudiar las respuestas de las células epiteliales a la exposición al CS. El protocolo consta de tres partes: el aislamiento de las células epiteliales de las vías de ratón tráquea, el cultivo de estas células en la interfase aire-líquido (ALI) como totalmente diferenciadas las células epiteliales, y la entrega de corriente calibrada CS de estas células en cultivo. El sistema de cultivo ALI permite la cultura de los epitelios respiratorio en condiciones que se asemejan más a su entorno fisiológico que los sistemas normales de cultivo líquidos. El estudio de las respuestas celulares y moleculares de pulmón a la exposición al CS es un componente crítico de la comprensión del impacto de la contaminación del aire ambiental en la salud humana. Resultados de la investigación en esta área en última instancia, pueden contribuir a la comprensión de la etiología de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y otras enfermedades relacionadas al tabaco, que representan a los principales problemas de salud global.
Protocol
Discussion
El protocolo que describe el aislamiento de las células epiteliales de ratón traqueal es una adaptación de los protocolos de You et al., 1, 2.3 y otros con modificaciones. Como con cualquier protocolo que describe aislamientos de células, el aspecto más importante es evitar la contaminación de bacterias u hongos patógenos mediante el uso de técnicas asépticas estrictas. Un segundo paso crítico es evitar la contaminación de fibroblastos de las culturas, que puede ser evitado por una cuidado…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a Emeka Ifedigbo de asistencia técnica y el Dr. Shivraj Tyagi por su valiosa experiencia. También agradecemos al Centro de NeuroDiscovery Harvard para obtener ayuda con la microscopía. Este trabajo fue apoyado en parte por una asociación americana del corazón predoctorales para conceder 09PRE2250120 Hilaire Lam, y las subvenciones del NIH, R01-HL60234, R01-HL55330, R01-HL079904, adjudicado a AMK Choi.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Ham’s F12 Medium 1X | Cellgro | MT-10-080-CM | With L-glutamine | |
| Pen/strep | Lonza | 17-602E | ||
| Pronase | Roche | 10165921001 | Streptomyces griseus | |
| Collagen I | BD biosciences | 354236 | From rat tail | |
| Acetic Acid | Sigma | 338826-25 | ||
| DNaseI | Sigma | DN25-100MG | From Bovine Pancreas | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1605-100 | Fraction V | |
| Retinoic Acid | Retinoic Acid | R265-50MG | ||
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14175 | Without Ca++ or Mg++ | |
| DMEM-F12 | Cellgro | MT-15-090-CM | Without L-Glutamine or HEPES | |
| HEPES, 1M in H2O | Sigma | 83264-100ML | ||
| L-Glutamine | Sigma | G7513-100ML | 200 mM | |
| Amphotericin B (Fungizone) | Fisher Scientific | 1672346 | ||
| Insulin | Sigma | 16634-50MG | Bovine Pancreas | |
| Apo-transferrin (human) | Sigma | T1147-100MG | ||
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | Vibrio Cholerae | |
| Epidermal growth factor | BD Biosciences | 354001 | Mouse | |
| Bovine pituitary Extract | BD Biosciences | 354123 | ||
| NuSerum | BD Biosciences | 355100 | ||
| Transwell | Corning Costar | 3401 | 12 mm, 0.4 mm Pore Polycarbonate |
|
| Primaria 100 mm culture dish | Falcon | 353803 | ||
| Pallflex membrane | Pall Life Sciences | EMFAB TX40H120-WW | ||
| Smoking Machine | EMI Services | ATCSALI-1 | see Footnote* |
*The cigarette smoking machine is a custom designed and fabricated 14″x14″x20″ Dual chambered and water jacketed light tint clear proof 1/2″ thick polycarbonate Lexan chamber for cigarette smoke exposure with temperature controlled, water level sensor controlled shut off system. A cigarette smoking/puffing unit is installed for a variable cigarette puffing rates. When the unit is in use, it mimics an incubator in the sense that the temperature, humidity and carbon dioxide are controlled in the system. The system includes: (I) a customized dual chamber/water jacketed unit that maintains a controlled environment for tissue culture experiments. (II) A digital heavy duty, high precision dual pump water temperature circulator system with water level sensor and temperature control (III) A cigarette smoking unit with puffing pump. (IV) A pump cycle sensor control rate cycler (IV) A Stainless steel high precision in-Line filter holder. (V) A Detachable lid mounted 11/2″ size axial uniformity cigarette smoke mixing fan. (VI) A medium size water bath with mounting bracket for the water circulator. (VII) A 1/2′ thick Plexiglas tray with brackets for the puff pump and holder for cigarette ash collector.
This machine as described can be substituted with similar commercially-available smoking machines such as the kind available from TSE systems (www.tse-systems.com).
Referências
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