Выделение мышью Респираторные эпителиальных клеток и воздействие экспериментальный сигаретный дым в воздухе жидкость
Summary
Легочная эпителиальных клеток может быть изолирована от респираторного тракта мышей и культивировали при воздушно-жидкостной интерфейс, модель дифференцированных дыхательного эпителия. Протокол описан для выделения, культивирования и разоблачение этих клеток в дыме сигарет, с целью изучения молекулярного ответов на этот экологических токсинов.
Abstract
Легочная эпителиальных клеток может быть изолирована от респираторного тракта мышей и культивировали при воздушно-жидкостной интерфейс (ALI) в качестве модели дифференцированных дыхательного эпителия. Протокол описан для изоляции и разоблачение этих клеток дыме сигарет (CS), с целью изучения эпителиальные клеточные реакции на воздействие CS. Протокол состоит из трех частей: изоляции дыхательных путей эпителиальные клетки мыши трахеи, культивирования этих клеток на воздух-жидкость (ALI) как полностью дифференцированные клетки эпителия, а также доставку калиброванный основной CS этих клеток в культуре. Система АЛИ культуры позволяет культуры эпителия дыхательных в условиях, которые больше напоминают их физиологические настройки по сравнению с обычными системами культуральной жидкости. Изучение молекулярных и легких клеточных реакций на воздействие CS является критически важным компонентом понимания воздействия загрязнения окружающей среды воздуха на здоровье человека. Результаты исследований в этой области в конечном итоге может способствовать пониманию этиологии хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ), а также других связанных с табаком болезней, которые являются основными глобальными проблемами со здоровьем.
Protocol
Discussion
Протокол описания изоляции мыши трахеи эпителиальных клеток взята из протоколов Вы и соавт., 1, и другие 2-3 с изменениями. Как и любой протокол описания выделения ячейки, наиболее важным аспектом является то, чтобы избежать загрязнения от бактериальной или грибковой пат…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Эмека Ifedigbo для оказания технической помощи и доктора Шиврадж Тяги за ценные знания. Мы также благодарим Центр Гарвардского NeuroDiscovery за помощью микроскопии. Эта работа была выполнена при частичной поддержке Американской ассоциации сердца Predoctoral грант 09PRE2250120 к Илер Лам, и NIH гранты, R01-HL60234, R01-HL55330, R01-HL079904, присуждена АМК Чой.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Ham’s F12 Medium 1X | Cellgro | MT-10-080-CM | With L-glutamine | |
| Pen/strep | Lonza | 17-602E | ||
| Pronase | Roche | 10165921001 | Streptomyces griseus | |
| Collagen I | BD biosciences | 354236 | From rat tail | |
| Acetic Acid | Sigma | 338826-25 | ||
| DNaseI | Sigma | DN25-100MG | From Bovine Pancreas | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1605-100 | Fraction V | |
| Retinoic Acid | Retinoic Acid | R265-50MG | ||
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14175 | Without Ca++ or Mg++ | |
| DMEM-F12 | Cellgro | MT-15-090-CM | Without L-Glutamine or HEPES | |
| HEPES, 1M in H2O | Sigma | 83264-100ML | ||
| L-Glutamine | Sigma | G7513-100ML | 200 mM | |
| Amphotericin B (Fungizone) | Fisher Scientific | 1672346 | ||
| Insulin | Sigma | 16634-50MG | Bovine Pancreas | |
| Apo-transferrin (human) | Sigma | T1147-100MG | ||
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | Vibrio Cholerae | |
| Epidermal growth factor | BD Biosciences | 354001 | Mouse | |
| Bovine pituitary Extract | BD Biosciences | 354123 | ||
| NuSerum | BD Biosciences | 355100 | ||
| Transwell | Corning Costar | 3401 | 12 mm, 0.4 mm Pore Polycarbonate |
|
| Primaria 100 mm culture dish | Falcon | 353803 | ||
| Pallflex membrane | Pall Life Sciences | EMFAB TX40H120-WW | ||
| Smoking Machine | EMI Services | ATCSALI-1 | see Footnote* |
*The cigarette smoking machine is a custom designed and fabricated 14″x14″x20″ Dual chambered and water jacketed light tint clear proof 1/2″ thick polycarbonate Lexan chamber for cigarette smoke exposure with temperature controlled, water level sensor controlled shut off system. A cigarette smoking/puffing unit is installed for a variable cigarette puffing rates. When the unit is in use, it mimics an incubator in the sense that the temperature, humidity and carbon dioxide are controlled in the system. The system includes: (I) a customized dual chamber/water jacketed unit that maintains a controlled environment for tissue culture experiments. (II) A digital heavy duty, high precision dual pump water temperature circulator system with water level sensor and temperature control (III) A cigarette smoking unit with puffing pump. (IV) A pump cycle sensor control rate cycler (IV) A Stainless steel high precision in-Line filter holder. (V) A Detachable lid mounted 11/2″ size axial uniformity cigarette smoke mixing fan. (VI) A medium size water bath with mounting bracket for the water circulator. (VII) A 1/2′ thick Plexiglas tray with brackets for the puff pump and holder for cigarette ash collector.
This machine as described can be substituted with similar commercially-available smoking machines such as the kind available from TSE systems (www.tse-systems.com).
Referências
- You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, L1315-L1320 (2002).
- Davidson, D. J. Murine epithelial cells: isolation and culture. J. Cyst. Fibros. 2, 59-62 (2004).
- Davidson, D. J., Kilanowski, F. M., Randell, S. H., Sheppard, D. N., Dorin, J. R. A primary culture model of differentiated murine tracheal epithelium. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 279, L766-L778 (2000).
- Rabe, K. F. et al.; Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease. Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease: GOLD executive summary. Am. J Respir. Crit. Care Med. 176, 532-555 (2007).
- Macnee, W. Pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease. Clin. Chest Med. 28, 479-513 (2007).
- Tuder, R. M., Yoshida, T., Arap, W., Pasqualini, R., Petrache, I. State of the art. Cellular and molecular mechanisms of alveolar destruction in emphysema: an evolutionary perspective. Proc. Am. Thorac. Soc. 3, 503-510 (2006).
- Yao, H., Rahman, I. Current concepts on the role of inflammation in COPD and lung cancer. Curr. Opin. Pharmacol. 9, 375-383 (2009).
- van der Toorn, M. Cigarette smoke irreversibly modifies glutathione in airway epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 293, L1156-L1162 (2007).
- Slebos, D. J. Mitochondrial localization and function of heme oxygenase-1 in cigarette smoke-induced cell death. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 36, 409-417 (2007).
- Kim, H. P. Autophagic proteins regulate cigarette smoke induced apoptosis: protective role of heme oxygenase-1. Autophagy. 4, 887-895 (2008).
- Chen, Z. H. Egr-1 regulates autophagy in cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease. PLoS ONE. 3, e3316-e3316 (2008).
- Okuwa, K. In vitro micronucleus assay for cigarette smoke using a whole smoke exposure system: A comparison of smoking regimens. Exp Toxicol Pathol. , (2009).
- St-Laurent, J., Proulx, L. I., Boulet, L. P., Bissonnette, E. Comparison of two in vitro models of cigarette smoke exposure. Inhal. Toxicol. 21, 1148-1153 (2009).
- Watson, A. M., Benton, A. S., Rose, M. C., Freishtat, R. J. Cigarette smoke alters tissue inhibitor of metalloproteinase 1 and matrix metalloproteinase 9 levels in the basolateral secretions of human asthmatic bronchial epithelium in vitro. J Investig. Med. 58, 725-729 (2010).
- Rennard, S. I. Cigarette smoke in research. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 31, 479-480 (2004).
- Shapiro, S. D. Smoke gets in your cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 31, 481-482 (2004).
