Isolamento de rato células epiteliais respiratórias e exposição à fumaça de cigarro Experimental da Air interface líquido
Summary
Células epiteliais pulmonares podem ser isolados do trato respiratório de camundongos e cultivadas em ar-líquido interface como um modelo de epitélio respiratório diferenciado. Um protocolo é descrito para o isolamento, cultura e expondo essas células à fumaça de cigarro mainstream, a fim de estudar as respostas moleculares para esta toxina ambiental.
Abstract
Células epiteliais pulmonares podem ser isolados do trato respiratório de camundongos e cultivadas em ar-líquido interface (ALI) como um modelo de epitélio respiratório diferenciado. Um protocolo é descrito para isolar e expor essas células à fumaça do cigarro convencional (CS), a fim de estudar as respostas das células epiteliais à exposição CS. O protocolo consiste em três partes: o isolamento de células epiteliais das vias aéreas a partir do mouse traquéia, o cultivo dessas células em ar-líquido interface (ALI) como totalmente diferenciada células epiteliais, ea entrega de calibrado principais CS a essas células em cultura. O sistema de cultura ALI permite a cultura do epitélio respiratório sob condições que se assemelham mais a sua configuração fisiológica do que sistemas de cultura comuns líquido. O estudo molecular de pulmão e respostas celulares à exposição CS é um componente crítico de compreensão do impacto da poluição do ar ambiente sobre a saúde humana. Resultados da investigação nesta área pode vir a contribuir para a compreensão da etiologia da doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), e outras doenças tabaco-relacionadas, que representam grandes problemas de saúde global.
Protocol
Discussion
O protocolo descrevendo o isolamento de células epiteliais do mouse traqueal é adaptado dos protocolos de Você et al., 1, 2-3 e outros com modificações. Como acontece com qualquer protocolo de isolamento de células descrevendo, o aspecto mais crítico é o de evitar a contaminação por patógenos, bacteriana ou fúngica, utilizando técnicas de assepsia rigorosa. Um segundo passo fundamental é evitar a contaminação das culturas de fibroblastos, que podem ser evitados por meio de dissecção…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Emeka Ifedigbo de assistência técnica e Shivraj Dr. Tyagi de conhecimentos valiosos. Agradecemos também o Centro NeuroDiscovery Harvard para a assistência com a microscopia. Este trabalho foi financiado em parte por uma Associação Americana do Coração Predoctoral conceder 09PRE2250120 para Hilaire Lam, e concede NIH, R01-HL60234, R01-HL55330, R01-HL079904, concedido a AMK Choi.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Ham’s F12 Medium 1X | Cellgro | MT-10-080-CM | With L-glutamine | |
| Pen/strep | Lonza | 17-602E | ||
| Pronase | Roche | 10165921001 | Streptomyces griseus | |
| Collagen I | BD biosciences | 354236 | From rat tail | |
| Acetic Acid | Sigma | 338826-25 | ||
| DNaseI | Sigma | DN25-100MG | From Bovine Pancreas | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1605-100 | Fraction V | |
| Retinoic Acid | Retinoic Acid | R265-50MG | ||
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14175 | Without Ca++ or Mg++ | |
| DMEM-F12 | Cellgro | MT-15-090-CM | Without L-Glutamine or HEPES | |
| HEPES, 1M in H2O | Sigma | 83264-100ML | ||
| L-Glutamine | Sigma | G7513-100ML | 200 mM | |
| Amphotericin B (Fungizone) | Fisher Scientific | 1672346 | ||
| Insulin | Sigma | 16634-50MG | Bovine Pancreas | |
| Apo-transferrin (human) | Sigma | T1147-100MG | ||
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | Vibrio Cholerae | |
| Epidermal growth factor | BD Biosciences | 354001 | Mouse | |
| Bovine pituitary Extract | BD Biosciences | 354123 | ||
| NuSerum | BD Biosciences | 355100 | ||
| Transwell | Corning Costar | 3401 | 12 mm, 0.4 mm Pore Polycarbonate |
|
| Primaria 100 mm culture dish | Falcon | 353803 | ||
| Pallflex membrane | Pall Life Sciences | EMFAB TX40H120-WW | ||
| Smoking Machine | EMI Services | ATCSALI-1 | see Footnote* |
*The cigarette smoking machine is a custom designed and fabricated 14″x14″x20″ Dual chambered and water jacketed light tint clear proof 1/2″ thick polycarbonate Lexan chamber for cigarette smoke exposure with temperature controlled, water level sensor controlled shut off system. A cigarette smoking/puffing unit is installed for a variable cigarette puffing rates. When the unit is in use, it mimics an incubator in the sense that the temperature, humidity and carbon dioxide are controlled in the system. The system includes: (I) a customized dual chamber/water jacketed unit that maintains a controlled environment for tissue culture experiments. (II) A digital heavy duty, high precision dual pump water temperature circulator system with water level sensor and temperature control (III) A cigarette smoking unit with puffing pump. (IV) A pump cycle sensor control rate cycler (IV) A Stainless steel high precision in-Line filter holder. (V) A Detachable lid mounted 11/2″ size axial uniformity cigarette smoke mixing fan. (VI) A medium size water bath with mounting bracket for the water circulator. (VII) A 1/2′ thick Plexiglas tray with brackets for the puff pump and holder for cigarette ash collector.
This machine as described can be substituted with similar commercially-available smoking machines such as the kind available from TSE systems (www.tse-systems.com).
Referências
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