Состав экстрактов полярных липидов и жирных кислот отдельных глицеролипидов определяются в простой и надежной эксперимент профилирования липидов. Для этой цели глицеролипидов изолированы с помощью тонкослойной хроматографии и подвергается трансметилирования их ацильных групп. Жирные ацил methylesters количественно с помощью газо-жидкостной хроматографии.
Биологические мембраны отдельные клетки от окружающей среды. Из одной клетки до многоклеточных растений и животных, глицеролипидов, такие как фосфатидилхолин или фосфатидилэтаноламина, форма бислоя мембран, которые действуют как обе границы и интерфейсы для химического обмена между клетками и окружающей средой. В отличие от животных, растительные клетки имеют специальные органеллы для фотосинтеза, хлоропласта. Сложная система мембран хлоропласта содержит уникальные глицеролипидов, а именно гликолипиды не хватает фосфора: monogalactosyldiacylglycerol (МГДГ), digalactosyldiacylglycerol (DGDG), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG) 4. Роль этих липидов не просто структурный. Эти и другие гликолипиды глицеролипидов были найдены в кристаллических структурах фотосистемы I и II с указанием участия в фотосинтезе глицеролипидов 8,11. Во время голодания фосфат, DGDG передается extraplastidic мембраны, чтобы компенсировать потери фосфолипиды 9,12.
Большая часть наших знаний о биосинтез и функции этих липидов, была получена из сочетания генетических и биохимических исследований с Arabidopsis thaliana 14. В ходе этих исследований, простая процедура анализа полярных липидов имеет огромное значение для отбора и анализа липидных мутантов и будут изложены в деталях. Экстракт листьев липидов первых, разделенных тонкослойной хроматографии (ТСХ) и глицеролипидов окрашиваются обратимо с парами йода. Отдельных липидов Царапины от пластины ТСХ и преобразуется в жирные ацильные methylesters (FAMEs), которые анализируются с помощью газо-жидкостной хроматографии в сочетании с пламенно-ионизационным обнаружения (ФИД-GLC) (рис. 1). Этот метод был доказан, чтобы быть надежным инструментом для скрининга мутантов. Например, tgd1, 2,3,4 эндоплазматической сети к пластид мутантов торговли липидного были обнаружены на основе накопления ненормальных galactoglycerolipid: trigalactosyldiacylglycerol (TGDG) и уменьшение относительного количества 18:3 (углероды: двуспальная облигаций), жирных ацильных групп в мембранных липидов 3,13,18,20. Этот метод также применяется для определения ферментативной активности белков использованием липидов в качестве субстрата 6.
ТСХ в сочетании с КЗС обеспечивает надежный и быстрый инструмент для количественного анализа полярных липидов в растениях. Небольшие изменения в липидный состав могут быть идентифицированы, поэтому этот метод был использован для скрининга большого масштаба мутантов нарушениями липидного в полярных метаболических путей 1,20. Этот метод также широко используется для мониторинга активности ферментов использованием полярных липидов в качестве субстрата. 2,6,7
Кроме листьев, липидный состав других тканей растений, таких как корни и семена или субклеточных фракций, таких как хлоропластов и митохондрий также может быть определено таким же образом.
Растворитель (ацетон, толуол, вода), используемая здесь, оптимизированный для разделения гликолипидов и фосфолипидов в растениях. Однако в tgd1, 2,3,4 мутантов и изолированных хлоропластов, TGDG работает вместе с ПЭ в то время как tetragalactosyldiacylglycerol работает с ПК. В этом случае система растворителя хлороформа, метанола, уксусной кислоты и воды (85: 20: 10: 4, объем / объем / объем / объем) используется 13. Иногда двумерной ТСХ с использованием двух различных системах растворителей производится дальнейшее разделение гликолипиды и фосфолипиды 19. Кроме того, растительные ткани могут быть непосредственно подвергаются FAME реакции следуют КЗС для определения общего жирных кислот без первоначального разделения на TLC 5. Кроме продемонстрировали TLC-GLC системой, другой метод, используемый для липидного профиля основан на прямом электрораспылением ионизации тандемной масс-спектрометрии 17. В этом методе начальной хроматографического разделения липидов в экстракте опускается. Однако этот метод требует дорогостоящего оборудования и квалифицированного персонала, что делает его менее полезным для рутинных анализов в лаборатории или у мутантов скрининга.
The authors have nothing to disclose.
Работа выполнена при поддержке за счет гранта Национального научного фонда США, чтобы Кристоф Беннинг.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
α-naphthol | Sigma-Aldrich | N1000 | ||
Methanolic HCL 3N | Sigma-Aldrich | 33050-U | Dilute to 1N by methanol | |
Si250-PA TLC plates | J.T.Baker | 7003-04 | With pre-absorbent | |
TLC chamber | Sigma-Aldrich | Z266000 | ||
Screw cap tubes | VWR | 53283-800 | ||
Scew caps | Sun Sri | 13-425 | ||
PTFE disk | Sun Sri | 200 608 | ||
GLC system | Hewlett Packard | HP6890 | ||
DB-23 column | J&W Scientific | 122-2332 | ||
GLC vials | Sun Sri | 500 132 | ||
Caps of GLC vials | Sun Sri | 201 828 | ||
Chemstation software | Agilent | G2070AA |