FISH для подготовки к имплантации генетическая диагностика

Summary

В этой статье описывается выбор подходящих зондов для одноклеточных FISH, распространение методов бластомеров ядер, и в гибридизация и сигнал скоринга, применительно к предимплантационной генетической диагностики (ПГД) в клинических условиях.

Abstract

Доимплантационной генетическая диагностика (ПГД) является признанным альтернатива дородовой диагностики и включает в себя выбор предымплантационного эмбрионов из когорты порожденных помощью технологии воспроизводства (АРТ). Этот выбор может потребоваться из-за семейной болезни моногенных (например, кистозный фиброз), или потому, что один из партнеров осуществляет хромосомных перестроек (например, двусторонние взаимные транслокации). ПГД доступна для пар, которые уже раньше пострадавших детей, и / или в случае хромосомных перестроек, повторные выкидыши или бесплодие. Ооциты атмосферный после стимуляции яичников оплодотворяются в пробирке погружение в сперме (ЭКО) или интрацитоплазматической инъекция сперматозоида отдельные (ИКСИ). Доимплантационной расщепления стадии эмбрионы биопсии, как правило, путем удаления одной клетки на 3 день после оплодотворения, и биопсию ячейка испытания для установления генетического статуса эмбриона. Флуоресцентный в гибридизация (FISH) на фиксированную ядер биопсию клетки с мишень-специфической ДНК-зондов является методом выбора для выявления хромосом дисбаланс связан с хромосомными перестройками, а также выбрать женских эмбрионов в семьях с Х-сцепленным заболеванием, для которого существует никакая мутация конкретного теста. FISH была также использована для скрининга эмбрионов для спонтанной анеуплоидии хромосомы (также известный как PGS или PGD-AS), с тем чтобы попытаться улучшить эффективность искусственного оплодотворения, однако прогностическая ценность этого теста с использованием распространения и FISH методике, описанной здесь скорее всего, будет неприемлемо низкой в ​​руках большинства людей и не рекомендуется для рутинного клинического использования. Мы опишем выбор подходящих зондов для одноклеточных FISH, распространение методов бластомеров ядер, и в гибридизация и сигнал скоринга, применительно к ПГД в клинических условиях.

Protocol

1. Лизирующий и распространение Nucleus от биопсию Бластомер Сотовые лизис буфера для распространения клетки (0,2% Tween20 в 0,01 М HCl, рН 2,0) должны быть готовы за 24 часа и хранится при температуре -20 ° C. Подготовка 100 мл и фильтруют 20 мл в 30 мл стерильного универсальный контейнер, используя стерильный шприц 20 мл и шприц фильтр. Внесите 1 мл аликвоты в 10-15 1,7 мл стерильные пробирки микроцентрифужных, близкие и этикетки труб до замораживания. Рекомендуется иметь два различных партий, это использовать, новая партия и предыдущей партии, которая была протестирована и может использоваться, если новая партия является неудовлетворительным. Размораживание лизис буфера при комнатной температуре за 30 минут до процедуры биопсии. Для практических целей рабочая температура будет от комнатной температуры до температуры стороны. Оценка небольшой круг (около 5 мм в диаметре) на нижней стороне амин покрытием слайд (например Genetix) с помощью пера алмазов и предварительно этикетке слайд с номер дела, уникальный номер слайда, дата и биопсии. Используйте отдельный слайд для каждой бластомеров в порядке, и этикетка с эмбрионом номер. Слайды должны быть маркированы с твердым карандашом, такие как 4H, и "уничтожены" с латексной перчатки для удаления графитовой пыли. Место небольшой объем буфера лизис внутри круга. Передача биопсии бластомеров в лизис буфера. При необходимости добавить лизис буфера внутри круга, пока клетка начинает лизировать; ячейка должна лизировать полностью и цитоплазмы разгона до буфера высохнет. Обратите внимание на ядре, чтобы он остается в пределах круга и не теряется, если ячейка не имеет ядро ​​или несколько ядер, биопсия другой ячейке. Оставьте слайд высохнуть на воздухе при комнатной температуре. 2. В гибридизация Единого Бластомер Nucleus Подготовка этанола серии (70, 90 и 100%) составил в стерильной дистиллированной воде. Включить и настроить горячие блока (например, Hybaid Omnislide или Vysis Hybrite) до 75 ° C. Размораживание зонды, вихрь, и центрифуга. Реагенты должны быть свидетелем и достоверно, что он правильный, прежде чем принять зонд смесью. Внесите объемы, указанные производителем, чтобы составить зонд смеси в 0,65 мл стерильную пробирку микроцентрифужных и вихря и центрифуги перед использованием. Общий объем зонд смесь должна быть достаточной для 2 мкл на ядре должны быть проверены и округленной до ближайших 10 мкл, чтобы запас прочности. Предварительная стирка слайды в банках Коплин использованием фосфатно-солевом буфере (PBS) (рН 7,0: 0,14 М NaCl, 3 мМ KCl, 10 мМ Na 2 HPO 4, 2 мМ KH 2 PO 4) в течение 5 мин при комнатной температуре. Промыть слайдов дважды в стерильной дистиллированной воде. Дегидрировать слайды с этанолом серии (70, 90 и 100%) в течение 2 минут каждый при комнатной температуре и воздушно-сухой. Обеспечить слайды полностью погружен, и если какой-либо графитовой пыли всплывает на поверхность, впитывают с чистой ткани. Запись положение ядра в пределах круга с визуализации с помощью микроскопа фазового контраста. Дегидрировать со 100% этилового спирта в течение 2 мин при комнатной температуре и воздушно-сухой. Нанести 2 мкл зонд смесью, и покрытие с 9 х 9 мм покровное (одна четверть 18 х 18 мм № 1 покровное). Печать края покровного стекла с резиновой цемента (например, корова Gum; Корова проверки правописания). Codenature скользит по горячей блок при 75 ° С в течение 5 мин, а затем гибридизуются слайды ночь (16-20 ч) во влажной камере при температуре 37 ° C. Зонд смесей, которые состоят исключительно из центромеры зондов (например, для пола связанные случаи) даст удовлетворительного результата через 60 мин гибридизации. Подготовка водяной бане с достаточной банки Коплин и тепла до 71 ° C. Подготовка 0.4x стандартный солевой цитрата (SSC) строгие промывочного раствора (рН 7,0 при 71 ° C, 0,06 М NaCl, 6 мм C 6 H 5 Na 3 O 7 · 2H 2 O) и тепла в водяную баню. Внесите 50 мл строгие мыть в Коплин банку требуется, и убедитесь, что температура 71 ° С непосредственно перед использованием, используя чистую термометр. Осторожно снимите резиновый клей от каждого слайда и смыть покровное использованием 4x SSC/0.05% Tween20 (рН 7,0) при комнатной температуре. Вымойте слайдов в 0.4x SSC строгие стирка при 71 ° С в течение 5 мин. Вымойте не более 6 слайдов на банку Коплин. Вымойте слайдов в 4x SSC/0.05% Tween20 при комнатной температуре в течение 2 мин. Если зонд смесь содержит косвенно меченым зондом (ы), процедить слайды лишнюю жидкость и применить 20 мкл флуоресцентно конъюгированных антител под 20 х 20 мм, квадрат парафильмом. Инкубировать во влажной камере при температуре 37 ° С в течение 15 мин. Удалить парафильмом и мыть один раз в 4-кратный SSC/0.05% Tween20 при комнатной температуре в течение 2 мин. Мыть два раза в течение 2 мин в PBSт комнатной температуры и слейте слайдов. Применить 6 мкл DAPI / Vectashield (160 нг 4 ',6-diamidino-2-фенилиндола дигидрохлорид в 1 мл Vectashield монтажа среды, Vector Laboratories) до 22 х 22 мм нет. 0 покровное и инвертировать скользить по покровным. Пятно и печатью края покровного стекла с прозрачным лаком ногтей. 3. Анализ использования флуоресцентного микроскопа соответствующее оборудование с соответствующими фильтрами для датчиков используется. Оценка сигналов прямой визуализации с помощью флуоресцентного микроскопа и одиночные полосовых фильтров для каждого флуорохромом в анализе. Каждое ядро ​​должно быть засчитан по двум аналитикам. Общее руководство должно привести к озвучивание одного сигнала, когда два близко расположенных сигналов меньше, чем на один домен (сигнал ширины) друг от друга, но суждение, основанное на опыте необходимо быть внимательным, чтобы интерпретировать сигналы различной величины, интенсивности и разделения. Используйте для обработки изображений (например, Исида, метасистемы, Altlussheim, Германия; CytoVision, Genetix), чтобы захватить образ ядра для подтверждения визуальной диагностики, а также для архивации изображений в качестве части плана обеспечения качества лабораторных исследований. 4. Представитель Результаты: Метафазных и интерфазных ядрах из культивируемых лимфоцитов периферической крови должны быть изучены, чтобы убедиться, что выбранный зонды, специфичные для транслокации хромосом, информативными для точек останова (subtelomere зонды должны скрещиваться только перемещаться сегментов и центромеры зонд (ы) для ориентированных сегмента (ов)) и сигналов в интерфазных ядрах должна быть яркой и дискретной. Скоринг количество сигналов для каждого датчика в 100 интерфазных ядрах от каждого партнера рекомендуется оценить эффективность анализа. В этом случае 2 сигналы были забиты в 95% -99% ядер для каждого зонда. На рисунке 1 показана метафазы и межфазных ядра от подготовки к взаимной транслокации между коротких плечах хромосомы 5 и 9. Сигналы в интерфазных ядрах бластомеров эмбриона из должна быть яркой и дискретных и забил с использованием отдельных полосового фильтра для используемых цветов. На рисунке 2 показан бластомеров ядра с нормальной картины сигнала (2 экземпляра для всех локусов испытания) в соответствии с нормальной или сбалансированной хромосомы дополнением для хромосомы 5 и 9, и ядром с ненормальным шаблон сигнала в соответствии с несбалансированным продукт транслокации , которая моносомия (один экземпляр) для транслокации сегмента хромосомы 5 и трисомии (3 копии) для транслокации сегмента хромосомы 9. Рисунок 1 распространению метафазы и межфазных ядра подготовленные из культивируемых лимфоцитов периферической крови от носителя взаимные транслокации между коротких плечах хромосомы 5 и 9 с точки останова на 5p14.3 и 9p24.1. 46, XY, т (5 ; 9) (p14.3;. p24.1) иш т (5; 9) (5ptel48-, 9ptel30 +; 9ptel30-, 5ptel48 +, 9cen +). FISH зондов были выбраны для обоих транслоцируется сегментов (5p14.3 → 5pter, красный Cytocell subtelomere5ptel48 TexasRed; 9p24.1 → 9pter, зеленый Cytocell subtelomere 9ptel30 FITC) и ориентированный сегмент хромосомы 9 (9p24.1 → 9qter, синий Abbott КЭП 9 альфа-спутник SpectrumAqua). Рисунок 2. Сигналы в ядрах бластомеров межфазной день ото-3 эмбрионов получены с помощью различных фильтров для каждого флуорохромом и объединены в составное изображение. (А) Два сигнала для каждого датчика указывает две копии каждого локуса, что согласуется с нормальной или сбалансированной дополнением для транслокации хромосом. (B) Один красный сигнал, три зеленых сигналов и два синих сигналов, указывающих на одну копию транслоцируется сегмента хромосомы 5, в трех экземплярах транслоцируется сегмента хромосомы 9 и две копии ориентированный сегмент хромосомы 9, что согласуется со смежными -1 сегрегации транслокации в результате несбалансированного продукта с моносомия для 5p14.3 → 5pter и трисомии для 9p24.1 → 9pter.

Discussion

Применение флуоресценции в гибридизация (FISH) в одной клетке эмбриона (бластомеров) представляет особых проблем, как в практической, а в интерпретации сигнала узор. Биопсию ячейки необходимо распространять в пределах заранее определенной зоны на слайде с тем чтобы облегчить ее локализации следующим рыбы; особой осторожностью следует принимать в том, чтобы ячейка лизированными, что цитоплазма была рассеяна, и, что ядро видна и нетронутыми, и, как диагноза зависит от результатов этой единственной клетки, строгие по подсчету и интерпретации руководящие принципы должны быть применены. Тем не менее, в опытных руках, FISH это мощная техника для предимплантационной генетической диагностики (ПГД) в клинической практике. Принцип ПГД рыбой в том, что мишень-специфической ДНК проб, соединенных с различными флуорохромами или гаптенов могут быть использованы для обнаружения копию ряд конкретных локусов, и таким образом обнаружить хромосому дисбаланс связан с мейоза сегрегация хромосомных перестроек (1), в том числе робертсоновских транслокации, реципрокных транслокаций, инверсий, и сложные перестановки (2). Рыба также может быть использован для выбора эмбрионов женского пола в семьях с Х-сцепленным заболеванием, для которого нет мутации конкретного теста (3, 4). Более спорно, FISH была также использована для выявления спорадических анеуплоидии хромосомы для того, чтобы попытаться улучшить эффективность искусственного оплодотворения (5, 6), однако прогностическая ценность этого теста с использованием FSIH, вероятно, будет неприемлемо низкой в ​​большинстве людей руки и не рекомендуется для рутинного клинического использования (7). Эта статья посвящена техническим аспектам и ограничения FISH применяется для клинических одноклеточных диагноз.

Методы распространения и закрепления одного бластомеров включают метанол / уксусная кислота (5, 8), твин / HCl (9), и сочетание Tween / HCl и метанол / уксусная кислота (10). Изменения включают гипотоническая обработка клеток до распространения и / или пепсина и параформальдегида лечение после фиксации. Метод должен быть надлежащим образом проверены для лаборатории (14). Твин / HCl метод подробно описан в этой статье. Твин / HCl метод технически прост и в высшей степени воспроизводимы в разных лабораториях. Этот метод может быть использован для получения одного ядра для FISH диагностики определения пола и хромосомных перестроек с приемлемой диагностической точности (7).

Зонд смеси можно комбинировать прямо и косвенно помечены меченых зондов и зондов от разных производителей. Зонды для известных полиморфных участков хромосом (11, 12), или те, известный перекрестной гибридизации значительно с другими хромосомами (13) следует избегать, хотя может использоваться, если доказано, что конкретные и подходит для ПГД по предварительному тестированию как на репродуктивное партнеров . Доступные флуорохромами / гаптенов и стратегии для различения зонды включают следующее: Texas Red (TR), флуоресцеин изотиоцианат (FITC), SpectrumGreen (Vysis), SpectrumOrange (Vysis), SpectrumAqua, биотинилированного зонда обнаружены с TR-авидин, FITC-авидин, или Су-5 стрептавидином (визуализируется использованием FarRed фильтр), сочетание красного и зеленого зонды для производства желтого сигнала, второй раунд гибридизации и третий цвет создана путем последовательного захвата SpectrumOrange использованием TexasRed и SpectrumGold фильтр).

Зонд множество, содержащее три зонды, специфичные для центромеры регионов X и Y хромосомы и аутосомы один, рекомендуется для определения пола (14), аутосомно-зонд используется для установления плоидности и тем самым провести различие между трисомии Х (2n, 47 , XXX) и триплоидии (3n, 69, XXX), а также между tetrasomy X (48, ХХХХ) и tetraploidy (4л, 92, ХХХХ). Типичный набор зонд применяется в этой ситуации является сочетание Abbott AneuVysion содержащих альфа-спутник X, Y, и 18; этот зонд набор был продемонстрирован имеют очень низкий уровень полиморфизма, и поэтому предварительная очистка рабочих из репродуктивного партнеров не требуется (14).

Зонд смесь для какой-либо конкретной перестройки должно: в идеале содержать зонды по крайней мере достаточно, чтобы обнаружить все ожидаемые продукты перестановки с хромосомными дисбаланс. Если это невозможно, зонд смесей, где незамеченными несбалансированной продукты были оценены как нежизнеспособное в узнаваемых беременности и, вероятно, имеют очень низкую распространенность может быть приемлемым (14). Быть проверено на культуре лимфоцитов метафаз с обеих репродуктивного партнеров. По крайней мере, десять метафазных должны быть проверены на предмет зонд специфичность, полиморфизмов и кросс-гибридизации, а для перевозчика перестройка хромосомы, чтобы гарантировать, что зонды гибридизации, как ожидается, различные сегменты перестановки. Кроме того, по меньшей мере 100 интерфазных ядрах из этих препаратов должен быть засчитан, оценить специфику сигнала, яркость и дискретности (14).

Commercial зонд PGS наборы доступны (например, Abbott MultiVysion РВ или ПГТ), ориентированных на хромосомах чаще оказываются в анеуплоидных продуктов зачатия, и в составе одного зонда на хромосому целенаправленными. Обычно ядро ​​может иметь второй гибридизации с зондами для дополнительной хромосомы обеспечение для анализа хромосом 13, 15, 16, 18, 21, 22 и XY (14). Прогностическая ценность этого теста с использованием распространения и FISH методике, описанной здесь, вероятно, будет неприемлемо низкой в ​​руки большинства людей, и она не рекомендуется для рутинного клинического использования (7, 15).

Такие методы, как сравнительный гибридизации генома (CGH) применительно к одной клетки способны, чтобы проверить на число копий каждой хромосомы (Wilton и соавт. 2001), и использование одиночных нуклеотидных полиморфизмов (SNP) массивы и количественный анализ (Уэллс и др. . 2008) или "karyomapping" генотипирования (Хэндисайда и соавт. 2009) являются перспективными альтернативных методов для обнаружения анеуплоидии хромосомы. Тем не менее, предел разрешающей способности и точности для сегмента дисбаланса остаются неопределенными, и вполне вероятно, что рыба будет оставаться методом выбора для хромосомных перестроек с участием небольших сегментов.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Hydrochloric Acid, 2.5L		VWR	101254H
Sodium Chloride, 5Kg		VWR	443827W
Potassium Chloride, 250g		VWR	26764.232
di-Sodium Hydrogen Orthophosphate Anhydrous, 500g		VWR	102494C
Potassium Dihydrogen Orthophosphate, 500g		VWR	10203 4B
Sodium Hydroxide Pellets, 500g		VWR	28245.265
Tween20, 500mL		VWR	663684B
Ethanol, 2.5L		VWR	8.18760.2500	Duty Paid
Tri-Sodium Citrate, 5Kg		VWR	27833.363
Cow Gum, 250mL		Cow Proofings Ltd.	No longer available	Old stocks can still be found in art shops
DAPI/Antifade ES, 0.125μg/mL, 500ul		Cytocell	DES500L	150μl vial rec’d with each Cytocell TEL Probe
Nail Varnish, 12mL		Boots	10088316001
Amine-coated Slides, 25		Genetix	K2615
DAPI, 0.1mL		Sigma-Aldrich	D-9542
Vectashield, 10mL		Vector Laboratories	H1000
Texas-Red-avidin, 0.001mL		Vector Laboratories	A-2016
FITC-avidin, 0.001mL		Vector Laboratories	A-2011
Cy-5 Streptavidin, 0.001mL		GE Healthcare	PA45001
Microcentrifuge Tubes, 1.75mL, box of 500		Thistle Scientific	AX-MCT-175-C
Microcentrifuge Tubes, 0.6mL, box of 1000		Thistle Scientific	AX-MCT-060-C-CS
30ml Universal Containers, box of 400		Sterilin	128B	Available from NHS Supply Chain, Cat No. KCP053
Hot Block
Spirit Burner Spirit Burner Socket Spirit Burner Wick		VWR VWR VWR	451-0107 451-3112 451-3111
Plugged Glass Pipettes		Fisher Scientific	PMK-300-052R
Dissecting Microscope		Wild Heerbrugg
Tissues, 100boxes		NHS SUPPLY CHAIN	MJT058
Metal Culture Trays
Plastic Melamine Trays		VWR	682-009
Oven
Mouth Pipette Mouthpiece		Scientific Laboratory Supplies	HAE3700
Tubing
Syringe Filter, 0.2μm pore size, 25mm diameter		Fisher Scientific	FDM-340-010U
Diamond Pen		VWR	818-0021
Hot Block for Slides		Thermo Hybaid	HBOSBB
Hybridization Chamber
Tissue Roll		NHS SUPPLY CHAIN	MJT004
Schieferdecker Jar		VWR	631-9313
Coplin Jar		VWR	631-9331
Forceps, Fine		VWR	232-2123
Forceps, Blunt		VWR	232-2113
1000mL Beaker		VWR	213-1642
Phase Contrast Microscope		Nikon	E200
Fibre-free Blotting Cards, box of 100		Fisher Scientific (Raymond Lamb)	SDE1
Blue-Frosted Microscope Slides, box of 100		Scientific Laboratory Supplies	MIC3022
Coverslips, 18x18mm, No. 1, box of 200		Scientific Laboratory Supplies	MIC3110
Coverslips, 22x22mm, No. 0, box of 200		Scientific Laboratory Supplies	MIC3104
Coverslips, 22x50mm, No. 0, box of 100		Scientific Laboratory Supplies	MIC3206
1mL Syringe, box of 100		NHS Supply Chain	FWC045
1mL Pipette Tip, 10racks of 1000		Thistle Scientific	AX-T-1000-C-L-R
Incubator		LEEC
Waterbath		Grant	W22
Alcohol Thermometer				Various sources available
pH Meter		Jenway	3305
pH Electrode		VWR	662-1759	BNC Plug to fit Jenway pH meter 3305
Heated Stirrer		Bibby	HC502
1mL Pasteur Pipettes, box of 500		Scientific Laboratory Supplies	PIP4202
Parafilm, 50mm x 75m		VWR	291-1214