时间失效成像的三维组织培养研究,单个细胞对原产于大脑皮层反应蛋白提取物分割神经节隆起的迁徙行为。
细胞迁移是一个共同的过程,导致脊椎动物的中枢神经系统的发展和成熟(阿唐,'99)。包括两个基本的神经类型:兴奋和抑制的大脑皮层。这些细胞出现在不同的地区,迁移到皮质,沿不同路线( 珀尔曼等,'98) 。抑制interneurons迁移切线方向从皮质来源,大多来自不同区域的神经节金榜(Gelman 等 ,'09;徐等 ,'04)。。他们的运动,需要精确的时空控制,对环境线索,以便为建立适当的细胞结构和大脑皮层连接(Caviness Rakic,'78,阿唐,'90; Rakic,'90)。要学习的迁徙行为产生的细胞增殖区的神经节金榜公司(GE) 在体外新生雪貂,我们使用一个在BD基质胶基质的三维文化的安排。文化设置包括两个GE植和从大脑皮层中提取和定位之间的植(Hasling 等 ,'03,谜语等 ,'97)。荧光乳胶Retrobeads第九吸附测试蛋白质的来源。经过2-3天文化,细胞开始出现在边缘外植体,呈现出倾向留在径向方向的组织。实时成像允许迁徙模式的观察,没有标签或标记的细胞的必要性。当暴露等时深挖皮质中提取的蛋白质获得分数,GE细胞显示个别细胞的定量动力学分析判断,不同的行为。
在这里,我们提出了一个简单的系统研究和分析化学信号的神经细胞的迁徙行为。体外迁移实验已用于识别影响运动细胞的胞外分子。我们的范式,确保每一个人的细胞研究具有3维(3D)环境与互动。文化细胞外植体的迁移,这是一个相当大的优势,被迫D -聚赖氨酸包被的盖玻片平坦的表面上移动,从而泯灭的相互作用与细胞外基质(如希尔施贝格等人'10 ; 8。倚天等。'07)。然而,跟踪细胞迁移的规模较大,它仍然二维,细胞水平的自由相比,在底部的玻璃盖玻片和基质胶,这是比较薄的顶面之间的空间垂直约束迁移。这样的设置可以容易的运动分析,仍然基本上是2维。以前类似的3D范例组成的GE植或嵌入在胶原或基质胶GE细胞重新聚集,就业,利用细胞的聚集,表达一个特定的信号蛋白作为一种化学信号源( 如Liodis等人'07; Martini等人'09。Nóbrega -佩雷拉等 '08; Wichterle 等'03)。坚持蛋白乳胶珠的形式,这里介绍的方法使用一个缓慢释放系统,以便在当地环境的持续的水平,这是比蛋白质直接添加到中期,使系统特别适合时可用金额蛋白质是有限的或复杂的蛋白质混合物进行测试时。珠的选择是有限的,以乳胶为基础的产品,包括其他材料,例如琼脂糖珠,各有不同的特点。为了进一步提高检测的密度,我们使用两个植apposed两侧的珠存款。要确保原产地的具体面积,我们作为一个细胞来源的神经节隆起植。我们评估了在内侧和外侧的神经节隆起部分的差异,但没有看到任何的差异。我们应该指出,这项研究使用的雪貂,在这个物种的内侧和外侧的神经节金榜保险丝比早些时候在啮齿类动物中(Poluch等'08) 。在文化作了时间(P0)的内侧和外侧的神经节金榜融合,即使许多填充大脑皮层的细胞仍在生成和迁移。但是,如果真正的同质源是首选的细胞,细胞悬液,可以从解剖组织编制,并直接与基质胶混合,或者降速,并产生沉淀打了个“植”。组织消化酶的使用,准备细胞悬液气馁,甚至残留的蛋白水解酶活性,可以在实验过程中液化基质胶。此外,尽职调查已经被应用到文化设置的时间。虽然基质胶需要一段时间的升温,以聚合,甚至一个暴露的基质胶小滴(在本议定书中所用的)的空气会导致干燥和一个,是坚不可摧的细胞迁移和它可以不被擦除的shell的结果略有延长期随后用新鲜的基质胶覆盖。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由国防部批准PT074620(SLJ)和美国国立卫生研究院资助R01NS245014(SLJ)的支持。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
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Neurobasal Medium (1X), liquid | Invitrogen | 21103-049 | |
N-2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502-048 | |
B-27 Supplement (50X) | Invitrogen | 0080085-SA | |
BD Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Biosciences | 354234 | |
Harris Uni-Core, 0.5mm size | Electron Microscopy Sciences | 69036-05 | Punch bore |
Green Retrobeads IX | Lumafluor, Inc. | Latex microspheres |