Ion Beam centrada Fresagem e Microscopia Eletrônica de Varredura do Tecido Cerebral

Summary

Este protocolo descreve como resina de tecido cerebral incorporado pode ser preparada e fotografada nas três dimensões do feixe de íons focalizado, microscópio eletrônico de varredura.

Abstract

Este protocolo descreve como de amostras biológicas, como o tecido cerebral, pode ser trabalhada em três dimensões usando o microscópio de íon focado feixe de elétrons / digitalização (FIB / SEM). As amostras são fixadas com aldeídos manchado metal, heavy utilizando tetróxido de ósmio e acetato de uranila. Em seguida, são desidratados com álcool e infiltradas com a resina, que é então endurecido. Usando um microscópio de luz e ultramicrótomo com navalhas de vidro, um pequeno bloco contendo os juros região próxima à superfície é feita. O bloco é então colocado dentro da FIB / SEM, eo feixe de íons usados ​​para cerca de um moinho de face vertical de um lado da quadra, próximo a esta região. Utilizando elétrons retroespalhados para a imagem das estruturas subjacentes, um pequeno rosto é, então, moída com um fino feixe de íons ea superfície examinado mais de perto para determinar a área exata da face a ser trabalhada e moído. Os parâmetros do microscópio são, então, definido de modo que o rosto é repetidamente moído e fotografada para que as imagens em série são coletados através de um volume do bloco. A pilha de imagem normalmente contêm voxels isotrópicos com dimensões como nm uma pequena 4 em cada direção. Esta qualidade de imagem em qualquer plano de imagem permite ao usuário analisar ultra-estrutura celular em qualquer ângulo de visão dentro da pilha de imagens.

Protocol

1. Fixação da amostra e incorporação de resina Amostras de tecido fresco e as células são fixadas por pelo menos duas horas em paraformaldeído 2% e glutaraldeído 2,5% em tampão fosfato 0,1 M em um pH de 7,4. O tamanho da amostra não deve exceder 0,150 milímetro de espessura para permitir a penetração adequada ou fixador, e não deve ser deixado na correção para mais de 12 horas. Colocar as amostras em frascos de cintilação 20ml de vidro e lavá-los três vezes, 5 minutos cada, em tampão cacodilato 0,1 M. Mancha com 1,5% (w / v) tetróxido de ósmio ferrocianeto de potássio e 1% (w / v) em tampão cacodilato 0,1 M (0,1 M, pH 7,4) por 30 minutos. Mancha com tetróxido de ósmio 1,0% (w / v) em tampão cacodilato 0,1 M por 30 minutos. Lave uma vez com água destilada duas vezes por 3 minutos. Mancha com 1% (w / v) acetato de uranila em água destilada duas vezes por 30 minutos. Enxágüe seções por 5 minutos em água destilada duas vezes, e depois desidratar em série de álcool graduada, 2 minutos cada mudança (1 x 50%, 1 x 70%, 1 x 90%, 1 x 95%, 2 x 100%). Incorporar em concentrações crescentes de resina Durcupan misturado com etanol, 30 minutos cada mudança, a partir de Durcupan 50% em etanol, seguido por: 70%, 90%, 95%, e depois de 100%. Substituir com Durcupan fresca e agitar lentamente por 4 horas. Seções lugar, usando palitos cocktail de madeira, em microscópios lâminas de vidro revestidas com agente molde de separação, e colocar em 65 ° C forno por 24 horas. 2. Preparação da amostra para o FIB / SEM Separar a camada de resina, contendo as amostras, de entre as duas lâminas de microscópio de vidro e lave bem para remover todo o molde separar agente. Usando um microscópio de luz transmitida com os objetivos de baixa potência, ou dissecar microscópio com iluminação transmitida, para identificar a região de interesse dentro da fatia de resina. Um pequeno corte (3 mm x 3 mm) quadrado ao redor da região de interesse usando uma lâmina de barbear e pau esta para o topo do bloco de resina em branco com cola acrílica (Figura 1). Espere 5 minutos para a cola para endurecer, e então prosseguir com a próxima etapa. Prenda o bloco para o titular do ulramicrotome e, usando a lupa em anexo, acabamento ao redor da região de interesse com uma lâmina de barbear até que apenas uma pequena pirâmide de restos de material. Ainda cortar o bloco, usando uma faca de vidro fixo no ultramicrótomo, de modo que a região de interesse pode ser precisamente localizado no que diz respeito às dimensões da superfície do bloco (Figura 1). Cortar uma borda do bloco, perto da região de interesse, de modo que um passo perpendicular é cortado através da amostra (Figura 1 e 2). Esta etapa forma o rosto de imagem (Figura 2). Remover o bloco do ultramicrótomo e fotografar a região de interesse dentro do bloco, utilizando um microscópio de luz transmitida. Corte o bloco cortado longe do topo da resina remanescente. Isso é feito usando viu um joalheiro e garante que apenas um pequeno bloco é colocado dentro do FIB / SEM. A altura total deste bloco não deve ser superior a 5 mm. Cola para bloquear a um stub de alumínio com pasta de carbono garantindo que o lado a ser trabalhada é na parte mais externa (Figura 1). Depois que a cola secar, o revestimento do bloco com uma fina camada de ouro (> 20 nm; Cressington sistema de evaporação a vácuo). 3. Imagem na FIB / SEM Com uma ampliação baixo, e utilizando elétrons secundários de imagem (5 kV, 0,5 NAMP), orientar o bloco de modo que a região de interesse escolhida eo lado do bloco a ser trabalhada é de frente para o operador (Figura 2 c, d). Orientar o bloco de modo que a face a ser trabalhada fica paralela ao feixe de moagem. Isto significa que feixe de elétrons é orientado a 54 ° a esta face (Figura 2 b). Usando um feixe de íons atual de 13-27 NAMPS em 30 kV remover uma faixa estreita de resina a partir da frente da região a ser trabalhada. Alternar para o modo de imagem retroespalhados para ver a cara moída que recobre a região de interesse. Usando a imagem de referência luz microscopia (tomada no passo 16) ea imagem da face moída localizar a região exata no bloco a ser moído e fotografada (Figura 2). Depositar uma camada protetora (aproximadamente 1 mícron de espessura) de carbono (ou metal), utilizando o sistema de injeção de gás do microscópio, sobre a superfície do bloco, acima da região de interesse (Figura 2). Usando uma corrente de 700 picoAmps, moinho finamente a região do bloco no qual as imagens finais serão tomadas. Deixe o feixe de moagem moinho completamente este rosto imagem até sem artefatos moagem pode ser visto no rosto. A fábrica completa da face é verificado observando alterações em cada imagem subseqüente em todo o campo de visão. Moagem inadequada pode também visto como listras brancas ou "cortinas" aparecendo vertically na imagem. Deixe o microscópio para, pelo menos, duas horas para todas as mudanças térmicas a se dissipar. Isso reduz o risco de que o bloco irá enfrentar drift durante o exame, resultando em imagens desalinhados. Selecionar os parâmetros para geração de imagens de microscópio do rosto em série. Garantir que o feixe de elétrons tem uma tensão que é baixo o suficiente para a imagem apenas uma profundidade muito superficial de material em face bloco. Isso também deve ser muito mais rasa do que a espessura da face para ser removido. Parâmetros típicos para geração de imagens são tensões entre 1,2-2,0 kV, com tamanhos de pixel entre 4-20 nm. O pixel habitar precisa de tempo para ser mantido em torno de 10 μsecs de modo que o tempo total para moer o rosto e adquirir uma imagem é mantido abaixo dos 2 minutos (Figura 3). 4. Segredos para o sucesso Passo 1) Verifique as amostras não são mais espessas do que 150 mícrons. Isto irá permitir uma penetração adequada das manchas diferentes e resina para o material. Isto pode ser conseguido pela secção das amostras com uma vibratome imediatamente após a fixação. Esta espessura é apropriado para o tecido cerebral. Outros tecidos precisam ser testados para garantir a fixação adequada e coloração. Etapa 3) As amostras devem ser distribuído gratuitamente em toda a solução, e não se agrupou em uma parte do frasco enquanto este fixador secundário é introduzido. Isto irá assegurar a máxima penetração da amostra e reduzir a amostra se tornar distorcidas durante esse processo de fixação. Isto é conseguido rodando suavemente as amostras dentro do frasco imediatamente após a solução é adicionada. Passo 15) Certifique-se que a região de interesse está localizado imediatamente abaixo (<30 microns) a superfície do bloco. Isto irá reduzir a quantidade de moagem pelo feixe de íons durante a fase de aquisição de imagem. Passo 22) O tempo de varredura do feixe de íons precisa ser adequa-da para garantir que o rosto de imagem inteiro é completamente moído. Moagem inadequada será mostrado como listras brancas, ou "cortinas" que aparece verticalmente para baixo o rosto de imagem. Passo 26) A face final, moído deve ser maior do que o cara que é imaginada. Isto é porque a resina moída é ejetado do bloco e redeposita na superfície do bloco nas imediações. Este redeposição pode interferir no campo de imagem de vista e é evitada por moagem uma área muito grande do que é imaginado. Para uma janela de imagem que é de 20 mícrons de largura, a face moída bloco é maior do que 30 microns de largura. Passo 29) É fundamental que os parâmetros de feixe de elétrons são tais que a imagem é gerada por elétrons que emergem apenas os primeiros poucos nanômetros da superfície do bloco. Este um acheved, minimizando a tensão a menos de 2 kV e garantindo que nenhum elétrons penetrar muito longe. Este é também ajudou usando uma tensão de rede no detector de modo que apenas o elétron com maior energia contribuem para a imagem final. Normalmente, uma tensão de 1,3 kV grade é usada para uma tensão de 1,5 kV imagem. 5. Resultados representativos: Figura 1. Preparação de bloco de resina. Resina) incorporado secção coronal (80 mícrons de espessura) através de um cérebro de rato adulto visto em um steromicroscope. A imagem mostra claramente a diferentes regiões do cérebro que pode ser cortado a partir da seção (b), utilizando uma lâmina de bisturi. Aqui, um quadrado de 1 mm a partir do córtex é removido e (c) preso a um bloco de resina em branco. D) O bloco de resina é então cortada com uma faca de vidro montada em um ultramicrótomo, e uma vez que o bloco foi reduzido para apenas deixar o região de interesse (e), um passo é cortar perpendicular à superfície frontal do material incorporado. f) Toda esta região cortada é então cortada do resto da resina e montados em um topo de alumínio prontas para o revestimento de metal e de imagem no microscópio eletrônico de varredura. Figura 2. Preparação do bloco para enfrentar FIB / SEM imagem. A) e b) mostram ilustrações do bloco e da borda que é moído para criar o rosto de imagem (indicado com a seta de duas pontas pretas). A posição do feixe de íons (branco) é mostrada paralelamente à face de imagem, eo feixe de elétrons (cinza) é mostrado batendo o rosto a 54 ° para o feixe de íons. C) mostra uma vista do bloco de tomadas com o feixe de elétrons e fotografada com os elétrons secundários. Ao longo deste lado do bloco de uma região escura (indicado com caixa branca pontilhada) mostra uma parte do rosto que foi mais ou menos moído (mostrado com duas cabeçased seta preta) para revelar a amostra subjacente. d) Quando esta região é fotografada usando apenas os elétrons retroespalhados o tecido incorporado pode ser visto. Aqui, a largura total da secção de tecido incorporado é indicado com uma seta dupla cabeça branca. Barra de escala em c) é de 100 microns. Figura 3. Imagens do um volume de tecido do cérebro com voxels isotrópicos. A) Invertida imagem contraste retroespalhados da face de blocos mostrando a ultra-estrutura dentro de uma região do cérebro do rato. Todas as membranas são visíveis, bem como estruturas macromoleculares grande. B) Um total de 1.600 imagens foram coletadas em cinco espaçamentos nm, resultando em uma pilha de imagens com voxels isotrópicos. C) Essa pilha pode ser trabalhada em qualquer plano com a mesma resolução. Esta imagem mostra conexão sináptica única que é imaginada no plano xy eo plano yz.

Discussion

A técnica da FIB / SEM funciona perfeitamente quando a região de interesse não é muito grande. O limite superior para um volume imaged depende do feixe de íons e da área que pode consistentemente moinho repetidamente durante muitas horas. Até agora isso tem sido feito com áreas de cerca de 60 x 60 microns, no entanto, imaging toda esta área não é possível com uma resolução de imagem adequada, principalmente devido ao fator tempo na coleta de uma imagem tão grande. Como exemplo, a 4 imagem kx 4 k com um pixel tempo de permanência de 10 microssegundos levaria 2 minutos e 40 segundos para adquirir, e para um campo de visão de 60 microns isso só dar um tamanho de pixel de 15 nm. Para geração de imagens da ultra-estrutura das células e tecidos, um tamanho de pixel menor é mais adequado, geralmente entre 4 e 10 nm / pixel. Para uma área de 60 x 60 microns a imagem seria adquirido em 10 horas, mesmo se o microscópio tinha essa capacidade. Por estas razões, o microscópio é uma ferramenta ideal para volumes de imagem na ordem de 10 x 10 x 10 microns, ou regiões significativas de células inteiras. Isso pode facilmente ser feito dentro de um período de 48 horas em amostras que são bem contrastadas com este procedimento.

Até agora, o protocolo tem sido usado principalmente com o tecido cerebral, bem como vários tipos de culturas de células de mamíferos aderir em lamínulas. No entanto, o procedimento de fixação e coloração pode ser usado com muitos outros tipos de material biológico, incluindo material de planta para produzir igualmente pilhas de imagens bem contrastadas.

Portanto, a principal vantagem desta técnica é a sua capacidade de volumes imagem com voxels isotrópicos. Pilhas de imagens deste tipo permitem a análise do volume 3D usando imagens feitas em qualquer avião na pilha. A vantagem disto é permitir que o observador a características de imagem na série de imagens de qualquer direção e proporcionando um maior detalhe de imagem (Figura 3).

Materials

Name of Reagent	Company	Catalogue number
Cyanoacrylate glue
Dissecting microscope: Leica MZ8	Leica Microsystems, Germany
Durcupan resin	Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Switzerland
FIB/SEM microscope (Zeiss, NVision 40)
Glass histology slides	Menzel-Gläser, Germany	AA00008032E
Glass knife maker: Leica EM KMR2	Leica Microsystems, Germany
Glass scintillation vials (20ml)	EMS, USA	72634
Glutaraldehyde	EMS, USA	16222
Jeweler’s saw	EMS, USA	72010
Mould separating agent	Glorex, Switzerland	62407445
Osmium tetroxide	EMS, USA	19110
Paraformaldehyde	EMS, USA	RT 19208
Phosphate salts for phosphate buffer	Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Switzerland	71642 and 71496
Sodium cacodylate	Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Switzerland	20840
Sputter Coater with gold target	Cressington, USA
Tris base (TBS)	Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Switzerland	T1378
Ultramicrotome: Leica UCT	Leica Microsystems, Germany
Uranyl acetate	EMS, USA	RT 22451