Le repiquage des cellules souches humaines
Summary
La capacité de manipuler humaine souches neurales / cellules précurseurs (hNSPCs) in vitro permet d'étudier leur utilité comme les greffes de cellules à des fins thérapeutiques et d'explorer le développement humain de neurones. Ce protocole présente une méthode de culture et de hNSPCs repiquage dans l'espoir de reproductibilité croissante de la recherche des cellules souches humaines.
Abstract
La capacité de manipuler humaine souches neurales / cellules précurseurs (hNSPCs) in vitro constitue un moyen d'étudier leur utilité comme les greffes de cellules à des fins thérapeutiques ainsi que d'explorer de nombreux processus fondamentaux du développement neuronal humain et la pathologie. Ce protocole présente une méthode simple de culture et de hNSPCs repiquage dans l'espoir de normaliser cette technique et en augmentant la reproductibilité de la recherche des cellules souches humaines. Le hNSPCs nous utilisons ont été isolés à partir de cadavres cortex cérébral post-natal par la National des Ressources Humaines des cellules souches neurales et cultivés comme cultures adhérentes sur les flacons enduits de fibronectine (Palmer et al, 2001;.. Schwartz et al, 2003). Nous la culture de notre hNSPCs dans un milieu DMEM: F12 milieu sans sérum complété par l'EGF, FGF et PDGF et le passage entre eux 01h02 environ tous les sept jours. En utilisant ces conditions, la majorité des cellules dans la culture de maintenir une morphologie bipolaire et expriment des marqueurs des cellules souches neurales indifférenciées (comme nestine et Sox2).
Protocol
Discussion
Nous avons trouvé que ce protocole fournit des cultures fiable de hNSPCs. Un facteur essentiel pour nos cellules est qu'elles doivent être maintenues en tant que cultures assez dense et ne peuvent pas être passées, au point que les cellules sont clairsemées. Dans nos mains, les cultures poussent très lentement clairsemées ou complètement cessent de se diviser. Pour cette raison, nous avons l'habitude diviser nos cultures 1:2 ou 1:3 quand une culture est extrêmement dense. Revêtement de la surface d'une boîte de cultur…
Acknowledgements
Les auteurs remercient le Dr Philip H. Schwartz, de la National des Ressources Humaines des cellules souches neurales à l'Hôpital des Enfants, le comté d'Orange Institut de recherche pour fournir hNSPCs et de l'instruction initiale dans leur culture.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| BIT-9500 (BSA, Insulin, Transferrin) | Reagent | Stem Cell Technologies | 09500 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Reagent | Invitrogen | 15240-062 | |
| DMEM:F12 (1X) | Reagent | Invitrogen | 11330-032 | |
| EMEM (1X) | Reagent | Mediatech | MT-10-010-CV | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | Invitrogen | 10437-028 | |
| FGF, human basic recombinant | Reagent | Peprotech | 100-18B | |
| PDGF-AB | Reagent | Peprotech | 100-00AB | |
| EGF, human recombinant | Reagent | BD Biosciences | CB40052 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Cell Culture Flask, 25 cm2 | Tool | Corning | 10-126-28 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Fibronectin, human, natural | Reagent | BD Biosciences | CB40008A | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Human Neural Stem/Precursor Cells | Cells | National Human Neural Stem Cell Resource http://www.nhnscr.org/default.htm | ||
| Cell Dissociation Buffer | Reagent | Invitrogen | 13150-016 |
Referências
- Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins. J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).
- Nethercott, H. N., Maxwell, H., Schwartz, P. H., Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. Neural stem cell culture. Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. , (2007).
- Palmer, T. D., Schwartz, P. H., Taupin, P., Kaspar, B., Stein, S. A., Gage, F. H. Cell culture. Progenitor cells from human brain after death. Nature. 411, 42-43 (2001).
- Schwartz, P. H., Bryant, P. J., Fuja, T. J., Su, H., O’Dowd, D. K., Klassen, H. Isolation and characterization of neural progenitor cells from post-mortem human cortex. J Neurosci Res. 74, 838-851 (2003).
