Passagierung humaner neuraler Stammzellen
Summary
Die Fähigkeit, menschliche neurale Stammzellen / Vorläuferzellen (hNSPCs) in vitro zu manipulieren, um ihre Eignung als Zelltransplantaten für therapeutische Zwecke zu untersuchen und für die menschliche Entwicklung des Nervensystems zu erforschen. Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Kultivierung und Passagierung hNSPCs in der Hoffnung, steigende Reproduzierbarkeit der Forschung mit menschlichen Stammzellen.
Abstract
Die Fähigkeit, menschliche neurale Stammzellen / Vorläuferzellen (hNSPCs) in vitro zu manipulieren bietet ein Mittel, um ihren Nutzen als Zell-Transplantationen für therapeutische Zwecke zu untersuchen sowie viele grundlegende Prozesse des menschlichen neuronalen Entwicklung und Pathologie zu erkunden. Dieses Protokoll stellt eine einfache Methode zur Kultivierung und Passagierung hNSPCs in der Hoffnung, die Standardisierung dieser Technik und die Reproduzierbarkeit erhöht der Forschung mit menschlichen Stammzellen. Die hNSPCs wir wurden von Leichen postnatalen Gehirn Kortex durch die National Human Neural Stem Cell Ressourcen isoliert und gezüchtet als adhärente Kulturen auf Flaschen mit Fibronektin (Palmer et al, 2001..; Schwartz et al, 2003) beschichtet. Wir Kultur unserer hNSPCs in DMEM: F12 serum-freien Medien mit EGF, FGF und PDGF ergänzt und Passage ihnen 01.02 etwa alle 7 Tage. Mit diesen Bedingungen halten die Mehrheit der Zellen in der Kultur eine bipolare Morphologie und auszudrücken Marker für undifferenzierte neurale Stammzellen (wie Nestin und Sox2).
Protocol
Discussion
Wir haben festgestellt, dass dieses Protokoll zuverlässig Kulturen hNSPCs bietet. Ein kritischer Faktor für unsere Zellen ist, dass sie als ziemlich dichte Kulturen gehalten werden und kann nicht bis zu dem Punkt, dass die Zellen spärlich sind passagiert werden müssen. In unseren Händen, wachsen spärlich Kulturen nur sehr langsam oder endgültig einzustellen Division. Aus diesem Grund haben wir in der Regel aufgeteilt unseren Kulturen 1:2 oder 1:3, wenn eine Kultur ist extrem dicht. Die Beschichtung der Oberfläche einer Kulturschale …
Acknowledgements
Die Autoren danken Dr. Philip H. Schwartz des National Human Neural Stem Cell Ressourcen an der Kinderklinik, Orange County Forschungsinstitut für die Bereitstellung hNSPCs und Einweisung in deren Kultivierung.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| BIT-9500 (BSA, Insulin, Transferrin) | Reagent | Stem Cell Technologies | 09500 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Reagent | Invitrogen | 15240-062 | |
| DMEM:F12 (1X) | Reagent | Invitrogen | 11330-032 | |
| EMEM (1X) | Reagent | Mediatech | MT-10-010-CV | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | Invitrogen | 10437-028 | |
| FGF, human basic recombinant | Reagent | Peprotech | 100-18B | |
| PDGF-AB | Reagent | Peprotech | 100-00AB | |
| EGF, human recombinant | Reagent | BD Biosciences | CB40052 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Cell Culture Flask, 25 cm2 | Tool | Corning | 10-126-28 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Fibronectin, human, natural | Reagent | BD Biosciences | CB40008A | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Human Neural Stem/Precursor Cells | Cells | National Human Neural Stem Cell Resource http://www.nhnscr.org/default.htm | ||
| Cell Dissociation Buffer | Reagent | Invitrogen | 13150-016 |
Referências
- Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins. J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).
- Nethercott, H. N., Maxwell, H., Schwartz, P. H., Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. Neural stem cell culture. Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. , (2007).
- Palmer, T. D., Schwartz, P. H., Taupin, P., Kaspar, B., Stein, S. A., Gage, F. H. Cell culture. Progenitor cells from human brain after death. Nature. 411, 42-43 (2001).
- Schwartz, P. H., Bryant, P. J., Fuja, T. J., Su, H., O’Dowd, D. K., Klassen, H. Isolation and characterization of neural progenitor cells from post-mortem human cortex. J Neurosci Res. 74, 838-851 (2003).
