Passage menselijke neurale stamcellen
Summary
De mogelijkheid om menselijke neurale stamcellen / precursor cellen (hNSPCs) te manipuleren in vitro het mogelijk maakt om hun bruikbaarheid te onderzoeken als cel transplantatie voor therapeutische doeleinden en voor de menselijke ontwikkeling van het zenuwstelsel te verkennen. Dit protocol bevat een methode voor het kweken en de passage hNSPCs in de hoop van de toenemende reproduceerbaarheid van het menselijk stamcelonderzoek.
Abstract
De mogelijkheid om menselijke neurale stamcellen / precursor cellen (hNSPCs) te manipuleren in vitro biedt een middel om hun bruikbaarheid te onderzoeken als cel transplantatie voor therapeutische doeleinden, alsmede voor vele fundamentele processen van de menselijke neurale ontwikkeling en pathologie te verkennen. Dit protocol biedt een eenvoudige methode van het kweken en de passage hNSPCs in de hoop de standaardisering van deze techniek en het vergroten van de reproduceerbaarheid van het menselijk stamcelonderzoek. De hNSPCs we gebruiken werden geïsoleerd uit dode postnatale hersenen cortex door de Nationale menselijke neurale stamcellen Resource en gegroeid als aanhanger culturen op flessen bekleed met fibronectine (Palmer et al., 2001;.. Schwartz et al., 2003). We cultuur onze hNSPCs in een DMEM: F12 serum-vrij medium aangevuld met EGF, FGF, en PDGF en passage hen 01u02 ongeveer om de zeven dagen. Met behulp van deze voorwaarden, de meerderheid van de cellen in de cultuur te behouden een bipolaire morfologie en uitdrukkelijke markers van ongedifferentieerde neurale stamcellen (zoals Nestin en Sox2).
Protocol
Discussion
We hebben ontdekt dat dit protocol een betrouwbare culturen van hNSPCs biedt. Een kritische factor voor onze cellen is dat ze moeten worden gehouden als tamelijk dicht culturen en kan niet worden gepasseerd om het punt dat de cellen schaars zijn. In onze handen, dun culturen groeien heel langzaam of helemaal niet meer te delen. Om deze reden hebben we doorgaans verdeeld onze culturen 1:2 of 1:3 als een cultuur is zeer dicht. Coating het oppervlak van een cultuur schotel met fibronectine is belangrijk, want het bevordert een goede celhechtin…
Acknowledgements
De auteurs dankbaar erkennen dr. Philip H. Schwartz van de National Human Resource Neural Stamcel op het Children's Hospital, Orange County Research Instituut voor het verstrekken van hNSPCs en de eerste instructie in hun kweken.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| BIT-9500 (BSA, Insulin, Transferrin) | Reagent | Stem Cell Technologies | 09500 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Reagent | Invitrogen | 15240-062 | |
| DMEM:F12 (1X) | Reagent | Invitrogen | 11330-032 | |
| EMEM (1X) | Reagent | Mediatech | MT-10-010-CV | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | Invitrogen | 10437-028 | |
| FGF, human basic recombinant | Reagent | Peprotech | 100-18B | |
| PDGF-AB | Reagent | Peprotech | 100-00AB | |
| EGF, human recombinant | Reagent | BD Biosciences | CB40052 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Cell Culture Flask, 25 cm2 | Tool | Corning | 10-126-28 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Fibronectin, human, natural | Reagent | BD Biosciences | CB40008A | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Human Neural Stem/Precursor Cells | Cells | National Human Neural Stem Cell Resource http://www.nhnscr.org/default.htm | ||
| Cell Dissociation Buffer | Reagent | Invitrogen | 13150-016 |
Referências
- Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins. J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).
- Nethercott, H. N., Maxwell, H., Schwartz, P. H., Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. Neural stem cell culture. Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. , (2007).
- Palmer, T. D., Schwartz, P. H., Taupin, P., Kaspar, B., Stein, S. A., Gage, F. H. Cell culture. Progenitor cells from human brain after death. Nature. 411, 42-43 (2001).
- Schwartz, P. H., Bryant, P. J., Fuja, T. J., Su, H., O’Dowd, D. K., Klassen, H. Isolation and characterization of neural progenitor cells from post-mortem human cortex. J Neurosci Res. 74, 838-851 (2003).
