Passaging cellule staminali neuronali
Summary
La capacità di manipolare le staminali neurali umane / precursore cellule (hNSPCs) in vitro permette di indagare la loro utilità come i trapianti di cellule a fini terapeutici e di esplorare lo sviluppo umano neurale. Questo protocollo presenta un metodo di coltura e hNSPCs passaging nella speranza di aumentare la riproducibilità della ricerca sulle cellule staminali.
Abstract
La capacità di manipolare le staminali neurali umane / precursore cellule (hNSPCs) in vitro fornisce un mezzo per indagare la loro utilità come i trapianti di cellule per scopi terapeutici e di esplorare molti processi fondamentali dello sviluppo umano neurale e patologia. Questo protocollo presenta un semplice metodo di coltura e hNSPCs passaging nella speranza di standardizzazione questa tecnica e aumentando la riproducibilità della ricerca sulle cellule staminali. Il hNSPCs che usiamo sono stati isolati da cadavere corteccia cerebrale postnatale dal National Human Resource cellule staminali neurali e cresciuto come culture aderente su fiaschi rivestiti con fibronectina (Palmer et al, 2001;.. Schwartz et al, 2003). Noi la nostra cultura hNSPCs in DMEM: F12 senza siero dei media integrato con EGF, FGF, PDGF e di passaggio e le 01:02 circa ogni sette giorni. Utilizzando queste condizioni, la maggior parte delle cellule in cultura mantenere una morfologia bipolare ed esprimono marker di cellule indifferenziate staminali neurali (come nestina e Sox2).
Protocol
Discussion
Abbiamo scoperto che questo protocollo offre culture affidabile hNSPCs. Un fattore critico per le nostre cellule è che hanno bisogno di essere mantenuto il più culture piuttosto denso e non possono essere diversi passaggi al punto che le cellule sono scarse. Nelle nostre mani, le culture sparse crescono molto lentamente o cessare completamente divisione. Per questo motivo, siamo soliti suddividere le nostre culture 1:2 o 1:3 quando una cultura è estremamente denso. Rivestimento della superficie di un piatto cultura con fibronectina è im…
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il Dott. Philip H. Schwartz del National Human Resource neurale delle cellule staminali presso l'Ospedale dei Bambini, Orange County Istituto di Ricerca per la fornitura di hNSPCs e l'istruzione iniziale nella loro coltura.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| BIT-9500 (BSA, Insulin, Transferrin) | Reagent | Stem Cell Technologies | 09500 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Reagent | Invitrogen | 15240-062 | |
| DMEM:F12 (1X) | Reagent | Invitrogen | 11330-032 | |
| EMEM (1X) | Reagent | Mediatech | MT-10-010-CV | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | Invitrogen | 10437-028 | |
| FGF, human basic recombinant | Reagent | Peprotech | 100-18B | |
| PDGF-AB | Reagent | Peprotech | 100-00AB | |
| EGF, human recombinant | Reagent | BD Biosciences | CB40052 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Cell Culture Flask, 25 cm2 | Tool | Corning | 10-126-28 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Fibronectin, human, natural | Reagent | BD Biosciences | CB40008A | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Human Neural Stem/Precursor Cells | Cells | National Human Neural Stem Cell Resource http://www.nhnscr.org/default.htm | ||
| Cell Dissociation Buffer | Reagent | Invitrogen | 13150-016 |
Referências
- Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins. J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).
- Nethercott, H. N., Maxwell, H., Schwartz, P. H., Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. Neural stem cell culture. Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. , (2007).
- Palmer, T. D., Schwartz, P. H., Taupin, P., Kaspar, B., Stein, S. A., Gage, F. H. Cell culture. Progenitor cells from human brain after death. Nature. 411, 42-43 (2001).
- Schwartz, P. H., Bryant, P. J., Fuja, T. J., Su, H., O’Dowd, D. K., Klassen, H. Isolation and characterization of neural progenitor cells from post-mortem human cortex. J Neurosci Res. 74, 838-851 (2003).
