Passaging mänskliga neurala stamceller
Summary
Förmågan att manipulera mänskliga neurala stamceller / föregångare celler (hNSPCs) in vitro gör det möjligt att undersöka deras nytta som cell transplantationer i terapeutiskt syfte och för att utforska människans neurala utveckling. Detta protokoll presenteras en metod för odling och passaging hNSPCs i hopp om att öka reproducerbarhet av mänskliga stamceller.
Abstract
Förmågan att manipulera mänskliga neurala stamceller / föregångare celler (hNSPCs) in vitro ger en möjlighet att undersöka deras nytta som cell transplantationer för terapeutiska ändamål samt att utforska många grundläggande processer av mänskliga neurala utveckling och patologi. Detta protokoll utgör en enkel metod för odling och passaging hNSPCs i hopp om att standardisera denna teknik och ökad reproducerbarhet av mänskliga stamceller. Det hNSPCs vi använder var isolerade från avliden efter födsel hjärnans cortex av National Human Neural Stem Cell Resurs och vuxit som anhängare kulturer på flaskor belagda med fibronektin (Palmer et al, 2001;.. Schwartz et al, 2003). Vi kulturen våra hNSPCs i en DMEM: F12 serumfritt medier kompletteras med fonden, FGF och PDGF och passagen dem 01:02 ungefär var sjunde dag. Med hjälp av dessa villkor, majoriteten av cellerna i kulturen upprätthålla en bipolär morfologi och uttrycka markörer för odifferentierade neurala stamceller (som nestin och sox2).
Protocol
Discussion
Vi har funnit att detta protokoll ger tillförlitliga kulturer hNSPCs. En kritisk faktor för våra celler är att de måste hållas som tämligen tät kulturer och kan inte passerats till den grad att cellerna är gles. I våra händer, glesa kulturer växer mycket långsamt eller helt upphör att dela sig. Av denna anledning delar vi oftast våra kulturer 1:2 eller 1:3 när en kultur är mycket tät. Beläggning ytan av en kultur fat med fibronektin är viktigt eftersom det främjar god cellbindning och migration, men till skillnad från …
Acknowledgements
Författarna erkänner tacksamt Dr Philip H. Schwartz av den nationella människorättskommissionen Neural Stem Cell Resurs vid barnsjukhuset i Orange County Forskningscentralen för att ge hNSPCs och inledande undervisning i sin odling.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| BIT-9500 (BSA, Insulin, Transferrin) | Reagent | Stem Cell Technologies | 09500 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Reagent | Invitrogen | 15240-062 | |
| DMEM:F12 (1X) | Reagent | Invitrogen | 11330-032 | |
| EMEM (1X) | Reagent | Mediatech | MT-10-010-CV | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | Invitrogen | 10437-028 | |
| FGF, human basic recombinant | Reagent | Peprotech | 100-18B | |
| PDGF-AB | Reagent | Peprotech | 100-00AB | |
| EGF, human recombinant | Reagent | BD Biosciences | CB40052 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Cell Culture Flask, 25 cm2 | Tool | Corning | 10-126-28 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Fibronectin, human, natural | Reagent | BD Biosciences | CB40008A | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Human Neural Stem/Precursor Cells | Cells | National Human Neural Stem Cell Resource http://www.nhnscr.org/default.htm | ||
| Cell Dissociation Buffer | Reagent | Invitrogen | 13150-016 |
Referências
- Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins. J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).
- Nethercott, H. N., Maxwell, H., Schwartz, P. H., Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. Neural stem cell culture. Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. , (2007).
- Palmer, T. D., Schwartz, P. H., Taupin, P., Kaspar, B., Stein, S. A., Gage, F. H. Cell culture. Progenitor cells from human brain after death. Nature. 411, 42-43 (2001).
- Schwartz, P. H., Bryant, P. J., Fuja, T. J., Su, H., O’Dowd, D. K., Klassen, H. Isolation and characterization of neural progenitor cells from post-mortem human cortex. J Neurosci Res. 74, 838-851 (2003).
