במאמר זה אנו מתארים שיטה פשוטה קצירת של תאים בודדים מתרבויות עכברוש העיקרי העצבית וניתוח transcriptome הבאים באמצעות הגברה ארנה. גישה זו היא להכליל לכל סוג תא.
ביטוי גנים רבים מסתמכים על טכניקות ניתוח חומר מבודד אוכלוסיות הטרוגנית של תאים או רקמות homogenates התאים בתרבית. 1,2,3 במקרה של המוח, אזורים כמו ההיפוקמפוס מכילים הסדר מורכב של תאים מסוגים שונים, כל אחד עם mRNA פרופילים שונים. היכולת קציר תאים בודדים מאפשר יותר בחקירה לעומק את ההבדלים מולקולרית בין ובתוך אוכלוסיות תאים. אנו מתארים שיטה פשוטה ומהירה של קצירת התאים לעיבוד נוסף. Pipettes משמש לעיתים קרובות electrophysiology מנוצלים לבודד (באמצעות שאיפה) תא עניין ובנוחות להפקיד אותו לתוך צינור Eppendorf לעיבוד נוסף עם כל מספר של טכניקות הביולוגיה המולקולרית. פרוטוקול שלנו יכול להיות שונה לקציר של דנדריטים של תרבית תאים או אפילו תאים בודדים מתוך פרוסות חריפה.
כמו כן, אנו מתארים את שיטת הגברה ארנה כיישום הזרם העיקרי של isolations תא בודד. שיטה זו פותחה בעבר כחלופה אחר ביטוי גנים טכניקות ניתוח כגון שעתוק, הפוך או בזמן אמת שרשרת התגובה פולימראז (PCR) על ידי המעבדה שלנו. 4,5,6,7,8 טכניקה זו מאפשרת הגברה ליניארית של RNA polyadenylated החל femtograms רק של החומר וכתוצאה מכך כמויות מיקרוגרם של antisense RNA. החומר מוגבר באופן ליניארי מספקת הערכה מדויקת יותר מאשר הגברה PCR מעריכי השפע היחסי של מרכיבי transcriptome של התא המבודד. ההליך הבסיסי מורכב משני סיבובים של הגברה. בקצרה, RNA פולימראז אתר מקדם T7 הוא שולב cDNA גדילי כפול נוצר מתוך תמלילי mRNA. לילה שעתוק במבחנה (IVT) התגובה מתבצעת לאחר מכן שבה T7-RNA פולימראז מייצר תמלילי antisense רבים מן cDNA גדילי כפול. הסיבוב השני חוזר על התהליך הזה, אבל עם כמה הבדלים טכניים מאז חומר המוצא היא antisense RNA. זהו תקן לחזור על הסיבוב השני, וכתוצאה מכך שלושה סיבובים של הגברה. לעתים קרובות, בסיבוב השלישי בתגובה שעתוק במבחנה מבוצע באמצעות triphosphates nucleoside biotinylated כך RNA antisense המיוצר יכול להיות הכלאה ו זוהה על microarray. 7,8
הערות ופתרון בעיות
טיפים כלליים על שיטות ביולוגיות מולקולריות
תרשים כללי של נוהל ארנה
איור 4A מדגים את הסיבוב הראשון של ההליך ארנה. בתגובה הגדיל הראשון, החלק poly-T של פריימר (DT) T7-אוליגו בוחר עבור מינים mRNA (מלבן לבן ארוך) באמצעות קשירה של זנבות פולה. רנ"א חלקם polyadenylated גם יהיה שנתפסו על ידי הליך זה. וחשוב יותר, עם זאת, RNAs הנפוץ ביותר בתא, RNAs ריבוזומלי, לא. אוליגו זה משמש פריימר עבור transcriptase הפוכה לסנתז גדיל משלים של cDNA (מלבן אפור ארוך) באמצעות ה-mRNA כתבנית. החלק T7 של פריימר (DT) T7-אוליגו משלבת את האמרגן T7-RNA פולימראז בתוך מסגרת עם antisense את רצף ה-mRNA אל ההתחלה. זה משמש מאוחר יותר את התגובה במבחנה ב שעתוק.
בשלב הבא, ה-mRNA ב היברידית mRNA / DNA שנוצר בשלב הקודם הוא הידרוליזה חלקית על ידי Rnase H ליצירת רנ"א "פריימרים" (מלבנים לבנים קטנים) דומה שברי Okazaki נוצר גדיל DNA סינתזה מפגרת. פולימראז ה-DNA אני משתמשת שברי RNA סינתזה DNA הממשלה באמצעות DNA משלים mRNA כתבנית. כשזה מגיע קטע הבא RNA, שלה 5 'ל 3' פעילות nuclease מסיר את ribonucleotides ומחליף אותם עם deoxyribonucleotides. האנזים דנ"א מתווסף ולקשור כל גדילי שם החלפת גדיל מוביל אינה שלמה. פולימראז ה-DNA T4 הוא הוסיף למלא את האזורים בהם שברי RNA שימש primers הראשוני פולימראז ה-DNA אני יוצר בוטה, הסתיים גדילי כפול cDNA כלומר מטוהרים אז לפני ביצוע התגובה IVT.
בתגובה IVT, T7-RNA פולימראז נקשר האמרגן T7 שולבו הכפול תקועים cDNA ו מסנתז antisense מולקולות RNA (מלבנים שחור ארוך) באמצעות גדיל תחושה כתבנית. זה משמש כצעד הגברה שבו אלפי מולקולות RNA antisense מיוצרים מולקולה כפולה כל cDNA תקועים (איור 4 א).
הסיבוב השני, כמתואר באיור 4 ב ', מתחיל עם תגובה שעתוק לאחור כי שונה במקצת מזו של הסיבוב הראשון מאז RNA המוצא היא antisense (מלבן שחור מוצק) וחסר הזנב polyadenylated כי היה ממוקד על ידי T7-אוליגו (DT) תחל בסיבוב הראשון. לכן, התגובה הזו היא ערוכה עם primers אקראית (קטן מלבנים אפורים) ו-RNA מפוגל לאחר מכן. התגובה גדיל השני הוא דרוך מכן על ידי פריימר (DT) T7-אוליגו, אשר נקשר את רצף פולי-A בסוף '3 של ה-RNA תחושה שנוצר בתגובה שעתוק שקדמו הפוך. תגובה נוספת IVT מתבצע באותו אופן כמו בסיבוב הראשון. בסיבוב השני הוא חזר על זה בדרך כלל לפחות פעם אחת להשיג שלושה סיבובים של הגברה מתא בודד.
יישומים
טכניקות אשר הצגנו במאמר זה יכול להיות מתורגם למספר רב של יישומים. פרוטוקול יחיד בידוד תא יכול להיות שונה לשימוש פרוסות חריפה. 14 למרות שטכנית יותר מאתגר, אותם עקרונות יחולו כהכנה זה חלופי. בנוסף, אם הגודל של פיפטה מותאם מעט הקלטות של הפיזיולוגיה של התאים יכולה להתבצע לפני הקציר המאפשר חקירה מבוקר היטב של המנגנונים המולקולריים מאחורי פלטי פיזיולוגיים. עוד שינוי קל הוא לבודד תהליכים סומה התא. 15 עבור יישום זה, לאסוף גופות בתא עם פיפטה אחת ולאחר מכן לחזור עם טפטפת טריים לאסוף 100-300 dendrit מזוההes או אקסונים לכל צינור האיסוף. 16
לאחר התאים נקצרו, השוואות שכיחותם של mRNA ויצירות יכול להתבצע בין שונים, גם בתוך אוכלוסיות תאים זהים. שילוב biotinylated-UTP לתוך ארנה בסיבוב השלישי מאפשר ניתוח microarray כדי לקבוע אלו שכיחותם היחסית mRNA. הרכב האוכלוסייה mRNA המקורי ניתן גם נקבע לאחר ההליך ארנה באמצעות רצף של הדור הבא. ארנה מוגבר יכול לשמש גם כדי לאשר את פנוטיפ התא המרה מחקרים בהם סט מלא של mRNAs מסוג אחד לתוך תא transfected סוג תא אחר כדי לגרום למעבר של פנוטיפ של סוג התא האחרון לתוך כי לשעבר, הליך שפותח על ידי המעבדה המכונה TIPeR. 17 מחקרים אלה הם שימושיים במיוחד עבור הלומדים מדינות מחלות פנוטיפים התא מחקרים כאלה מתקיימים כיום במעבדה. RT-PCR או qPCR יכול להתבצע על החומר מוגבר כדי לאשר את הביטוי של גנים ספציפיים בתא. בנוסף, הערכות של היעילות של transfection או התמרה יכול להתבצע ברמת תא בודד.
יתרונות ומגבלות
כאמור באופן מופשט, בידוד של תאים בודדים לניתוח מבטל את ההשפעות בממוצע ראיתי עם ניתוח של אוכלוסיות תאים הטרוגנית. תופעות בממוצע לסלף שכיחותם mRNA בתוך תא בודד על ידי יתר המייצג תמלילי שפע בממוצע בחוץ ומניעת גילוי נמוכה שפע תעתיקים רבים. Cytometry זרימה ניתן להשתמש כדי למיין תאים בודדים, אך שיטה זו דורשת ידע סמנים ספציפיים של התא וציוד יקר. ללכוד 18 microdissection לייזר או עם UV או IR microdissection מערכות לייזר ללכוד לאפשר תא בודד ואפילו ללכוד subcellular אבל דורש תאים עניין להיות ממוקם על פני השטח של חלקים דק מאוד. 19 בדומה cytometry זרימה, microdissection לייזר ללכוד גם דורש ציוד יקר.
אחד היתרונות העיקריים של השיטה אלקטרודה מבוסס אוסף שתוארו לעיל היא כי נתונים אלקטרו יקר ניתן להשיג התא עניין לפני הקציר, דבר המאפשר ניתוח פונקציונלי transcriptome להתבצע על באותו תא. 20 החיסרון של הטכניקה שלנו זה דורש ניסיון באמצעות micromanipulators. החוקרים מכירים micromanipulators ימצאו טכניקה זו מאוד אינטואיטיבי, עם זאת, אנשים עם ניסיון כזה צריך להיות נוח עם התנועות בסדר הנדרש.
הטמון בטכניקה כל הגברה היא הגברה מועדף של תמלילי מסוימים על סמך גודל והרכב נוקלאוטיד. 4,6,7 שרשרת פולימראז התגובה (PCR) טכניקות המבוססות כגון תגובה הפוכה תעתיק פולימראז שרשרת (RT-PCR) ו הגברה המהירה של cDNA מסתיים (RACE) לגרום הגברה אקספוננציאלית של תמלילי, בעוד ההליך הגברה תוצאות ארנה ב הגברה ליניארית. לכן, אחד היתרונות הגדולים של ההליך ארנה הוא ביכולת טובה יותר לשמר את שכיחותם היחסית של תעתיקי mRNA רק באופן ליניארי על ידי הגברה שגיאות או הטיות המתרחשות בתהליך הגברה בניגוד הגברה אקספוננציאלית אמר שגיאות הטיות.
ההליך ארנה בשילוב עם ניתוח microarray מאפשר להשוות את שכיחותם mRNA בין תאים בודדים של מורפולוגיה דומה או שונה, או מטופלים מטופל. בנוסף, חומר מוגבר ניתן להגיש עבור סידור הדור הבא. 5,8 עם זאת, יש להיזהר בניתוחים כאלה שכן, בניגוד לשימוש primers אקראי עבור ההליך, את ההליך אוליגו DT-דרוך שתוארו לעיל הגברה הטיות של "3 הקצוות של ה-mRNA, ובדרך כלל התוצאות קיצור קל של חומר מוגבר לאחר מכן עם כל סיבוב. יש להקפיד בניתוח תוצאות microarray עם שיטות סטנדרטיות כמו כמה שיחות נעדר שווא יכול לנבוע חומר מוגבר מקוצרת מעט. בנוסף, תוצאות תוך רצף אכן מספקים את מלוא 5 "רצף של רוב mRNA המקורי, 5" רצפים של mRNA מסוימים עשויים לפספס. מסיבות אלה, מספר סיבובים של amplifications צריך להיות מוגבל.
The authors have nothing to disclose.
תודה קווין Miyashiro עבור ציפוי ושמירה על תרביות תאים, ד"ר טרי שוחט למתן בתרביות תאים עבור התמונות הכלולים במסמך זה. בנוסף, תודה קווין Miyashiro, ד"ר פיטר באקלי, ו Tiina Pertiz עבור קלט על ההליך ארנה. מימון עבור עבודה זו היה מן המכון הלאומי להזדקנות, המכון הלאומי לבריאות הנפש ואת משאבי אנוש Finder עובדה כספים Commonwealth פנסילבניה.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Spiegelgas coverslips | Carolina Biological | 63-3029 | ||
Nunc 35×10 mm culture dishes | Fisher | 12-565-90 | ||
Water for cell culture | Lonza | 17-724Q | For making solutions used for cell culture and rinsing coverslips | |
Poly-D-Lysine MW70-150K | Sigma | 6407 | ||
Laminin, ultrapure | BD Bioscience | 354239 | ||
Boric acid | Sigma | B0252 | ||
MEM with Earle’s salts and glutamax | Invitrogen | 41090-101 | For plating cells | |
D-glucose | Sigma | G8769 | ||
Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
Horse serum | Invitrogen | 16050 | ||
Cytosine beta-D-arabinofuranoside | Sigma | C1768 | ||
MEM with Earle’s salts and L-glutamine | Invitrogen | 11095-098 | For growing cells | |
Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | ||
B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504-044 | ||
Borosilicate glass capillary tubes (1.5mm O.D, 100mm length) | Kimble Chase | 34500 99 | Any borosilicate glass pipette will work as long as the proper bore size is attained. | |
HBSS | Invitrogen | 14175 | Any solution will work as long as the components won’t interfere with any future processing (i.e. no Ca2+ or Mg2+) | |
1ml syringe | BD | 309628 | ||
Needle | BD | Gauge depends on the diameter of the pipettes | ||
dNTP mix | Amersham | 28-4065-51 | ||
dt-T7 oligo | Custom | Midland Certified | ||
Second strand buffer (5x) | Invitrogen | Y01129 | ||
DTT | Supplied with second strand buffer | |||
E.coli DNA Ligase | Invitrogen | 100002324 | ||
DNA polymerase I | Invitrogen | 100004926 | ||
Rnase H | Invitrogen | 18021-071 | ||
Megascript T7 kit | Ambion | AM1334 | ||
Random primers | BMB | 11034731001 | ||
Superscript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 56575 | in kit (18080-044) comes with first strand buffer (Y02321) and DTT | |
MEGAclear Kit | Ambion | 1908 | ||
MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28206 | ||
T4 DNA polymerase | Invitrogen | 100004994 | ||
Rnasin | Promega | N251B | ||
Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit | Ambion | AMIL1791 | ||
Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instruments | P-87 | Sutter has many other models, many are discussed in the cookbook | |
Micromanipulator | Olympus | Many other micromanipulators will work such as the newer Eppendorf models | ||
Pipette Holder | Warner Instruments | MP-S15A | Will vary with micromanipulator and pipette O.D. | |
Bioanalyzer RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 |