ترنسفكأيشن من خلايا الشبكية بواسطة الماوس العقدة في الجسم الحي Electroporation
Summary
علينا إثبات وجود<em> في الجسم الحي</em> بروتوكول electroporation transfecting لمجموعات واحد أو عقدة صغيرة من الخلايا الشبكية (RGCs) وغيرها من أنواع الخلايا الشبكية في الفئران بعد الولادة أكثر من مجموعة واسعة من الأعمار. القدرة على التسمية والتلاعب وراثيا RGCs بعد الولادة<em> في الجسم الحي</em> هو أداة قوية للدراسات الإنمائية.
Abstract
استهداف وتنقيح التوقعات RGC إلى الدماغ المتوسط هو نظام النموذج الشعبي وقوية لدراسة أنماط كيفية الربط الدقيق لشكل العصبية خلال التنمية. في الفئران ، ويتم ترتيب التوقعات retinofugal بطريقة الطبوغرافية وشكل العين طبقات معينة في النواة الركبية الجانبية (dLGN) من المهاد وأكيمة فخمة (SC). وعادة ما يتم وضع هذه الأنماط دقيقة من الإسقاطات التي يدرسها retinofugal وسم سكان RGCs مع الأصباغ الفلورية واستشفاف ، مثل الفجل البيروكسيداز 1-4. ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب الخشنة جدا لتوفير نظرة ثاقبة التغييرات التنموية في التشكل الفردية RGC محواري الشجرة التي هي أساس تشكيل الخريطة شبكي التوضع. كما أنها لا تسمح للتلاعب الجيني للRGCs.
في الآونة الأخيرة ، أصبح electroporation وسيلة فعالة لتوفير تحكم دقيق المكاني والزماني للتسليم من الجزيئات المشحونة في شبكية العين 11/05. البروتوكولات الشبكية الحالية electroporation لا تسمح للتلاعب الجيني وتتبع التوقعات retinofugal من كتلة واحدة أو قليل من RGCs في الفئران بعد الولادة. فقد قيل أن في فترة ما بعد الولادة electroporation فيفو ليست طريقة سليمة للtransfecting RGCs منذ كفاءة منخفضة للغاية وضع العلامات ، وبالتالي يتطلب تستهدف الأعمار الجنينية عند الأسلاف RGC تشهد التمايز والانتشار 6.
في هذا الفيديو تصف لنا في بروتوكول electroporation فيفو لتسليم المستهدفة من الجينات ، shRNA وdextrans الفلورسنت لRGCs الفئران بعد الولادة. هذا الأسلوب يوفر فعالة من حيث التكلفة وسريعة وسهلة نسبيا منصة لفحص كفاءة المرشحين من الجينات تشارك في العديد من جوانب التنمية بما في ذلك تراجع المحوار العصبية ، المتفرعة ، التصفيح ، وتجديد وتشكيل المشبك في مراحل مختلفة من التطوير الدائرة. باختصار نحن هنا وصف أداة قيمة التي ستوفر مزيدا من الإيضاحات عن الآليات الجزيئية الكامنة وراء الحسي التنمية الخريطة.
Protocol
Discussion
في هذا الفيديو إثبات وجود لنا في بروتوكول electroporation المجراة أن النتائج في مجموعات واحدة من العلامات أو صغيرة من الخلايا العصبية للشبكية في الفئران بعد الولادة مع الحمض النووي الترميز يبني البروتينات الفلورية. مستنسخة مجموعات صغيرة من إسقاطات RGC fluorescently المس…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
كان البلازميد pCAG – gapEGFP هدية من الدكتور س. ماكونيل (ستانفورد ، كاليفورنيا). وكان pCAG – tdTomato البلازميد هدية من الدكتور محمد فيلر (بيركلي ، كاليفورنيا). نشكر الدكتور إدوارد Ruthazer لاقتراح استخدام استراتيجية ثنائية البلازميد لوصفها خلية واحدة وSchohl آن (مونتريال ، QC) للتثبت من صحة اثنين البلازميد لجنة المساواة العرقية / loxP استراتيجية في الدراسات التجريبية وأفراد المختبر Crair للدعم التقني. بدعم من R01 MH62639 (MC) ، NIH R01 EY015788 (MC) ، والمعاهد الوطنية للصحة P30 EY000785 (MC).
Materials
| Materials | Company | Catalog number |
|---|---|---|
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 |
| Electrical Stimulator | Grass Instruments | Model S4 |
| Oscilloscope | Agilent | Model 54621A |
| Audio monitor | Grass Instruments | Model AM8B |
| Puller | Sutter Instruments | Model P-97 |
| Vannas Scissors a | World Precision Instruments | 14003 |
| Micro Scissors b | Ted Pella | 1347 |
| Dumont AA Forceps c | Fine Science Tools | 11210-20 |
| Nanoinject II System | Drummond Scientific | 3-000-204 |
| Glass Pipettes | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X |
| Foot pedal | Drummond Scientific | 3-000-026 |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M3516 |
| DiI | Invitrogen | D-383 |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma | D4551 |
Referências
- Huberman, A. D., Feller, M. B., Chapman, B. Mechanisms underlying development of visual maps and receptive fields. Annu Rev Neurosci. 31, 479-509 (2008).
- McLaughlin, T., Torborg, C. L., Feller, M. B., O’Leary, D. D. Retinotopic map refinement requires spontaneous retinal waves during a brief critical period of development. Neuron. 40, 1147-1160 (2003).
- Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. Prenatal and postnatal development of retinogeniculate and retinocollicular projections in the mouse. J Comp Neurol. 230, 552-575 (1984).
- Jaubert-Miazza, L. Structural and functional composition of the developing retinogeniculate pathway in the mouse. Vis Neurosci. 22, 661-676 (2005).
- Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation. BMC Dev Biol. 7, 103-103 (2007).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Analysis of gene function in the retina. Methods Mol Biol. 423, 259-278 (2008).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. J Vis Exp. , (2009).
- Ishikawa, H. Effect of GDNF gene transfer into axotomized retinal ganglion cells using in vivo electroporation with a contact lens-type electrode. Gene Ther. 12, 289-298 (2005).
- Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J Vis Exp. , (2008).
- Ruthazer, E. S., Haas, K., Javaherian, A., Jensen, K., Sin, W. C., Cline, H. T., Yuste, R., Konnerth, A. In vivo time- lapse imaging of neuronal development. Imaging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual. , 191-204 .
- Kachi, S., Oshima, Y., Esumi, N., Kachi, M., Rogers, B., Zack, D. J., Campochiaro, P. A. Nonviral ocular gene transfer. Gene Ther. 12, 843-851 (2005).
- Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein. Exp Neurol. 156, 394-406 (1999).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 1027-1032 (2007).
- Plas, D. T. morphogenetic proteins, eye patterning, and retinocollicular map formation in the mouse. J Neurosci. 28, 7057-7067 (2008).
