Live-Imaging van de Cel Extrusie van de opperhuid van de ontwikkelingslanden zebravis
Summary
Stervende cellen zijn geëxtrudeerd uit epitheelweefsels door gezamenlijke contractie van naburige cellen zonder verstoring van de barrièrefunctie. De optische helderheid van ontwikkelen zebravis biedt een uitstekende systeem om extrusie visualiseren in levende epithelia. Hier beschrijven we methoden om te induceren en imago extrusie in het larvale zebravis epidermis op cellulair resolutie.
Abstract
Homeostatische onderhoud van epitheelweefsels vereist de voortdurende verwijderen van beschadigde cellen zonder verstoren barrièrefunctie. Onze studies hebben gevonden dat stervende cellen signalen sturen naar hun live buren om vormen en contract een ring van actine en myosine dat het uitgeworpen uit het epitheliale terwijl het vel sluiten eventuele lacunes die misschien hebben geresulteerd uit zijn afrit, een proces genoemd cel extrusie 1. De optische helderheid van ontwikkelen zebravis biedt een uitstekende systeem om extrusie visualiseren in levende epithelia. Hier beschrijven we één methode om induceren en imago extrusie in de larvale zebravis epidermis. Tot visualiseren extrusie, we injecteren een rode fluorescerend eiwit gelabelde probe voor F-actine in een-cellig stadium transgene zebravis embryo uitdrukken groen fluorescerend proteïne in de epidermis en induceren apoptose door toevoeging van G418 naar larven. Vervolgens gebruiken we time-lapse imaging op een spinning disc confocale microscoop te actine dynamiek en epitheelcellen gedragingen observeren tijdens het proces van apoptotische cel extrusie. Deze aanpak laat ons toe het extrusieproces onderzoeken in live epithelia en zal een laan om ziekte toestanden veroorzaakt door het onvermogen om apoptotische cellen elimineren bestuderen.
Protocol
Discussion
Het protocol hier beschreven demonstreert een eenvoudige en doeltreffende methode om het proces van extrusie visualiseren in een live epitheelweefsel. Dit type van experiment laat ons toe om te onderzoeken subtiliteiten van actine dynamiek nog niet eerder op prijs gesteld in vaste weefsel analyses, en daarom een aanvulling op gemeenschappelijke immunofluorescentie methoden. We kunnen dit protocol in combinatie met chemische remmers of genetische mutanten beter te analyseren het extrusieproces en studie ziektebeeld…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de leden van de Rosenblatt laboratorium voor wetenschappelijke discussies, suggesties en opmerkingen. We willen ook graag aan Maria Halloran die vriendelijk op voorwaarde dat de plasmide coderend voor RFP-UtrCH en David Grunwald, die op voorwaarde dat de CK bedanken: GFP transgene zebravis. Dank ook aan Gretchen Koning en het personeel van de Centrale zebravis Resource aan de Universiteit van Utah voor een uitstekende onderhoud en de verzorging van de zebravis. Dit werk werd ondersteund door New Innovator Award NIH-NIGMS NIH directeur een DP2 OD002056-01 naar JR. GTE werd ondersteund door NIH Multidisciplinaire Cancer Training Program Grant 5T32 CA03247-8.
Materials
| Name | Tipo | Company | Catalog Number | Comments |
|---|---|---|---|---|
| RNeasy Mini Kit | Reagent | Qiagen | 74104 | |
| mMessage mMachine SP6 Kit | Reagent | Ambion | AM1340 | |
| Crossing Tanks | Tool | Thoren Aquatic Systems | ||
| The Pipet Pump | Tool | Bel Art Products | F3789 | |
| 5 ¾ Pasteur Pipet | Tool | VWR | 14672-608 | |
| Microinjection Mold | Tool | Adaptive Science Tools | I-34 | |
| 100x15mm Culture Plate | Tool | Fisher | 08-757-12 | |
| Flamming/Brown Micropipet Puller | Tool | Sutter Instrument Company | Model P97 | |
| Borosilicate Glass Capillaries with Filament | Tool | Sutter Instrument Company | B1400-78-10 | OD 1.0mm, ID 0.78mm, 10cm length |
| Electrode Storage Jar | Tool | World Precision Instruments | E210 | |
| Phenol Red | Reagent | Sigma | P0290 | 0.5% in DPBS |
| Pressure-Controlled Microinjector and Micromanipulator | Tool | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| 35x10mm Culture Dish | Tool | Cellstar | 627-160 | |
| G418 (Geneticin) | Reagent | GIBCO | 10131-035 | 50 mg/mL in dH20 |
| Dumont #5 Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| 12cm Pin Holder | Tool | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Insert Pins | Tool | Fine Science Tools | 26007-02 and-03 | |
| Glass Bottom Culture Dish with 1.5 coverglass | Tool | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Low Melt Agarose | Reagent | Fisher | BP1360-100 | |
| Tricaine | Reagent | Sigma | A-5040 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Leica | MZ6 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Fluorescent Dissecting Microscope | Microscope | Olympus | S2X12 | |
| Spinning Disc Confocal Microscope | Microscope | Nikon | Eclipse Ti | Outfitted with a Yokagawa spinning disc head |
| CCD Camera | Camera | Andor | DV-885-VP | 1002x1004x8 micron square pixels |
Referências
- Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism. Curr Biol. 11, 1847-1857 (2001).
- Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio). Int J Dev Biol. 48, 217-231 (2004).
- Slattum, G., McGee, K. M., Rosenblatt, J. P115 RhoGEF and microtubules decide the direction apoptotic cells extrude from an epithelium. J Cell Biol. 186, 693-702 (2009).
- Burkel, B. M., Dassow, G. v. o. n., Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell Motil Cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).
- Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo. Dev Biol. 324, 236-244 (2008).
- Gong, Z. fluorescent protein expression in germ-line transmitted transgenic zebrafish under a stratified epithelial promoter from keratin8. Dev Dyn. 223, 204-215 (2002).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book, A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2009).
- Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat Protoc. 3, 948-954 (2008).
