Translocación polarizado de proteínas fluorescentes en Xenopus Ectodermo en respuesta a la señalización de Wnt
Summary
Ectodermo embrionario de Xenopus se ha convertido en un atractivo modelo para el estudio de la polaridad celular. Un ensayo se describe, en el que la distribución subcelular de las proteínas fluorescentes se evalúa en las células de ectodermo. Este protocolo ayudará a contestar preguntas relacionadas con el control espacial de la señalización.
Abstract
Polaridad celular es una propiedad fundamental de las células eucariotas que es dinámica regulada por factores tanto intrínsecos como extrínsecos durante el desarrollo embrionario de 1, 2. Una de las vías de señalización implicadas en el presente Reglamento es la vía Wnt, que se utiliza muchas veces durante la embriogénesis y la crítica de la enfermedad humana 3, 4, 5. Múltiples componentes moleculares de esta vía de señalización de forma coordinada regular de manera espacialmente restringida, pero los mecanismos subyacentes no se comprenden totalmente. Xenopus células epiteliales embrionarias es un excelente sistema para estudiar la localización subcelular de las diferentes proteínas de señalización. Las proteínas fluorescentes de fusión se expresan en los embriones de Xenopus por microinyección de ARN, los explantes ectodérmica se preparan y localización de la proteína es evaluada por epifluorescencia. En este protocolo experimental se describe cómo la localización subcelular de Diversin, una proteína citoplasmática que se ha implicado en la señalización celular y la determinación de la polaridad de 6, 7 se visualiza en Xenopus células ectodérmicas para estudiar la transducción de señales Wnt 8. Co-expresión de un ligando Wnt o un receptor Frizzled altera la distribución de Diversin fusionada con la proteína fluorescente de color rojo, RFP, y recluta a la membrana celular de una manera polarizada 8, 9. Este protocolo ex vivo debe ser una adición útil a los estudios in vitro de células de mamífero cultivadas, en el que el control espacial de la señalización difiere de la del tejido intacto y es mucho más difícil de analizar.
Protocol
Discussion
Hemos utilizado el protocolo anterior para caracterizar la localización subcelular de Diversin. En los explantes de polo animal, Diversin-RFP se detectó al lado del núcleo y colocalized con g-tubulina, un marcador centrosomal, en cryosections (Figura 1). Una vez que la localización subcelular de una proteína se identifica, supresión construcciones se pueden generar para establecer dominios de la proteína que son necesarias y suficientes para la localización subcelular. Con este enfoque, los dominios de la locali…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Investigación en el laboratorio Sokol es patrocinado por el institutos agregados Nacional de Salud.
Referências
- Gurdon, J. B. Embryonic induction — molecular aspects. Development. 99, 285-306 (1987).
- Moody, S. A. . Principles of Developmental Genetics. , (2007).
- Clevers, H. Wnt/beta-catenin signaling in development and disease. Cell. 127, 469-480 (2006).
- Klaus, A., Birchmeier, W. Wnt signalling and its impact on development and cancer. Nat Rev Cancer. 8, 387-398 (2008).
- Gordon, M. D., Nusse, R. Wnt signaling: multiple pathways, multiple receptors, and multiple transcription factors. J Biol Chem. 281, 22429-22433 (2006).
- Schwarz-Romond, T., Asbrand, C., Bakkers, J., Kuhl, M., Schaeffer, H. J., Huelsken, J., Behrens, J., Hammerschmidt, M., Birchmeier, W. The ankyrin repeat protein Diversin recruits Casein kinase Iepsilon to the beta-catenin degradation complex and acts in both canonical Wnt and Wnt/JNK signaling. Genes Dev. 16, 2073-2084 (2002).
- Moeller, H., Jenny, A., Schaeffer, H. J., Schwarz-Romond, T., Mlodzik, M., Hammerschmidt, M., Birchmeier, W. Diversin regulates heart formation and gastrulation movements in development. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 15900-15905 (2006).
- Itoh, K., Jenny, A., Mlodzik, M., Sokol, S. Y. Centrosomal localization of Diversin and its relevance to Wnt signaling. J. Cell Sci. 122, 3791-3798 (2009).
- Itoh, K., Jacob, J., Sokol, Y. S. A role for Xenopus Frizzled 8 in dorsal development. Mech Dev. 74, 145-157 (1998).
- Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage. Cell. 30, 675-686 (1982).
- Itoh, K., Brott, B. K., Bae, G. U., Ratcliffe, M. J., Sokol, S. Y. Nuclear localization is required for Dishevelled function in Wnt/beta-catenin signaling. J Biol. 4, 3-3 (2005).
