Transmembraan domein oligomerisatie Propensity bepaald door ToxR Assay
Summary
Een efficiënte procedure om de oligomerisatie neiging van single-pass transmembraan-domeinen (TMDs) te beoordelen wordt beschreven. Chimère eiwitten bestaande uit de TMD gefuseerd aan ToxR worden uitgedrukt in een E. coli stam verslaggever. TMD-geïnduceerde oligomerisatie oorzaken dimerisatie van ToxR, activatie van transcriptie en de productie van de reporter eiwit-galactosidase.
Abstract
De ongenuanceerde weergave van eiwitten transmembraan-domeinen als slechts ankers in fosfolipide is allang weerlegd. In veel gevallen membraan-spanning eiwitten geëvolueerd zeer geavanceerde werkingsmechanismen. 1-3 Een van de manieren waarop membraaneiwitten kunnen moduleren hun structuren en functies is door direct contact en specifiek van hydrofobe helices, de vorming van gestructureerde transmembraan oligomeren. 4,5 veel recente werk is gericht op de verdeling van aminozuren bij voorkeur gevonden in het membraan milieu in vergelijking met waterige oplossing en de verschillende intermoleculaire krachten die rijden eiwit vereniging. niettemin 6,7, studies van moleculaire herkenning bij het transmembraan domein van eiwitten nog steeds achterblijft bij die van de water-oplosbare regio's. Een belangrijk struikelblok blijft: ondanks de opmerkelijke specificiteit en affiniteit die transmembraan oligomerisatie kan bereiken, 8 directe meting van hun vereniging is een uitdaging. Traditionele methoden toegepast op de studie van integrale membraaneiwit functie kan worden bemoeilijkt door de inherente onoplosbaarheid van de sequenties in onderzoek. Biofysische inzichten uit het bestuderen van synthetische peptiden die transmembraan-domeinen kan nuttige structureel inzicht. Echter, de biologische relevantie van het detergens micellaire of liposoom systemen die worden gebruikt in deze studies aan de celmembranen na te bootsen vaak in twijfel getrokken; peptiden hebben een native-achtige structuur vast te stellen onder deze omstandigheden en die hun functionele gedrag een reële afspiegeling van de wijze van actie binnen een native membraan ? Om de interacties van transmembraan-sequenties in natuurlijke fosfolipide studie, de Langosch lab ontwikkelde ToxR transcriptionele reporter assays. 9 De transmembraan domein van belang is uitgedrukt als een chimeer eiwit met maltose-bindend eiwit voor de locatie aan de periplasma en ToxR om een verslag op te stellen van het niveau van de oligomerisatie (figuur 1).
In het laatste decennium, verschillende andere groepen (bijvoorbeeld Engelman, DeGrado, Shai) verder geoptimaliseerd en paste deze ToxR reporter assay. 10-13 De verschillende ToxR assays zijn uitgegroeid tot een gouden standaard voor eiwit-eiwit interacties test in celmembranen. We laten zien hierin een typisch experimentele operatie uitgevoerd in ons laboratorium, dat in de eerste plaats volgt protocollen ontwikkeld door Langosch. Deze algemeen toepasbare methode is bruikbaar voor de analyse van transmembraandomein zelfassociatie in E. coli, waar de β-galactosidase productie wordt gebruikt om de TMD oligomerisatie neiging te beoordelen. Bij TMD-geïnduceerde dimerisatie, ToxR bindt zich aan de ctx promotor veroorzaakt up-regulatie van het lacZ-gen voor β-galactosidase. Een colorimetrische uitlezing wordt verkregen door toevoeging van ONPG aan lyzed cellen. Hydrolytische splitsing van ONPG door β-galactosidase resulteert in de productie van het licht absorberende soort o-nitrofenolaat (ONP) (figuur 2).
Protocol
Discussion
De ToxR transcriptionele reporter assay is een gemakkelijke manier om transmembraan sequenties te identificeren met de potentie om oligomerize. Omdat de interacties die zich in de bacteriële binnenste membraan, deze test omzeilt de kwesties in verband met de geldigheid van het bestuderen van systemen in membraan-mimetische omgevingen. Gezien het feit dat het klonen van meerdere TMDs in een plasmide gemakkelijk kan parallel worden uitgevoerd en de gehele test kan worden uitgevoerd in 96-well plaat formaat, kan deze test…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken de National Institutes of Health (1R21CA138373 en Stand Up naar Kanker (SU2C) voor financiële ondersteuning van dit werk. HY is dankbaar voor de 2009 Elion Award van de American Association of Cancer Research, een Kimmel Scholar Award van het Sidney Kimmel Stichting voor Cancer Research (SKF-08-101), en de National Science Foundation Faculteit Early Career Award (NSF0954819).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| BamHI restriction enzyme | Invitrogen | 15201023 | Invitrogen enzymes were found to be more efficient than alternative suppliers |
| NheI restriction enzyme | Invitrogen | 15444011 | Invitrogen enzymes were found to be more efficient than alternative suppliers |
| 15 mL culture tubes | Fisher Scientific | 14-956-1J | |
| SOC media | Teknova | S0225 | Made up to the appropriate volume and sterilized by autoclaving. |
| LB media | Sigma-Aldrich | L7275 | Made up to the appropriate volume and sterilized by autoclaving. |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | CO378 | Stock solution of 30 mg/ mL in ethanol stored in freezer |
| Arabinose | Fluka | 10839 | Stock solution of 2.5% (w/v) in water stored in freezer |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| KCl | Mallinckrodt Chemicals | 6858-06 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 63138 | |
| Sodium dodecylsulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| 2-Nitrophenyl β-D-galactopyranoside (ONPG) | Sigma-Aldrich | 73660 | |
| Z-buffer | 16.1 g Na2HPO4 5.5g NaH2PO4 0.75g KCl 0.246g MgSO4 Make up to 1 l, pH 7.0 |
||
| Z-buffer/chloroform | 200 mL β-mercaptoethanol, 2 mL chloroform, make up to 20 mL with Z-buffer. Vortex for 1 min, centrifuge for 1 min at 800 rpm. Make fresh for each plate. | ||
| Z-buffer/SDS | 160 mg SDS dissolved in 10 mL Z-buffer | ||
| Z-buffer/ONPG | 40 mg ONPG in 10 mL Z-buffer. Make fresh for each plate | ||
| β-mercaptoethanol | Calbiochem | 444203 | |
| Anti-MBP monoclonal antibody (HRP conjugated) | NEB | E8038S | |
| Minimal media with maltose | 1 x M9 salts, 0.4% maltose, 1 mg/ mL thiamin, 2 mM MgSO4 | ||
| 96-well flat bottom plate | Sarstedt | 83.1835.300 | |
| Plate-reader | Beckman Coulter | DTX880 Multimode Detector | |
| Water bath | VWRI | 89032-204 | |
| Shaking incubator | FormaScientific |
References
- Parker, M. S. Oligomerization of the heptahelical G protein coupling receptors: a case for association using transmembrane helices. Mini Rev Med Chem. 9, 329-339 (2009).
- Mo, W., Zhang, J. T. Oligomerization of human ATP-binding cassette transporters and its potential significance in human disease. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5, 1049-1063 (2009).
- von Heijne, G. Membrane-protein topology. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 909-918 (2006).
- Van Horn, W. D. Solution nuclear magnetic resonance structure of membrane-integral diacylglycerol kinase. Science. 324, 1726-1729 (2009).
- Hattori, M. Mg(2+)-dependent gating of bacterial MgtE channel underlies Mg(2+) homeostasis. Embo J. 28, 3602-3612 (2009).
- Ulmschneider, M. B., Sansom, M. S. Amino acid distributions in integral membrane protein structures. Biochim Biophys Acta. 1512, 1-14 (2001).
- Deber, C. M., Goto, N. K. Folding proteins into membranes. Nat Struct Biol. 3, 815-818 (1996).
- Gerber, D., Shai, Y. In vivo detection of hetero-association of glycophorin-A and its mutants within the membrane. J Biol Chem. 276, 31229-31232 (2001).
- Langosch, D., Brosig, B., Kolmar, H. p., Fritz, H. J. Dimerisation of the glycophorin A transmembrane segment in membranes probed with the ToxR transcription activator. J Mol Biol. 263, 525-530 (1996).
- Russ, W. P., Engelman, D. M. TOXCAT: a measure of transmembrane helix association in a biological membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 863-868 (1999).
- Berger, B. W. Consensus motif for integrin transmembrane helix association. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 703-708 (2010).
- Oates, J., King, G., Dixon, A. M. Strong oligomerization behavior of PDGFbeta receptor transmembrane domain and its regulation by the juxtamembrane regions. Biochim Biophys Acta. 1798, 605-615 (2010).
- Sal-Man, N., Gerber, D., Shai, Y. Hetero-assembly between all-L- and all-D-amino acid transmembrane domains: forces involved and implication for inactivation of membrane proteins. J Mol Biol. 344, 855-864 (2004).
- Sammond, D. W. Transmembrane peptides used to investigate the homo-oligomeric interface and binding hot-spot of the oncogene, latent membrane protein 1. , (2010).
- Li, R. Dimerization of the transmembrane domain of Integrin alphaIIb subunit in cell membranes. J Biol Chem. 279, 26666-26673 (2004).
- Ruan, W., Becker, V., Klingmuller, U., Langosch, D. The interface between self-assembling erythropoietin receptor transmembrane segments corresponds to a membrane-spanning leucine zipper. J Biol Chem. 279, 3273-3279 (2004).
- Finger, C., Escher, C., Schneider, D. The single transmembrane domains of human receptor tyrosine kinases encode self-interactions. Sci Signal. 2, ra56-ra56 (2009).
