דומיין הטרנסממברני Oligomerization הנטייה נקבע על ידי Assay ToxR
Summary
הליך יעיל להעריך את הנטייה oligomerization יחיד לעבור תחומים הטרנסממברני (TMDS) מתואר. חלבונים כימרי המורכב TMD התמזגו ToxR באים לידי ביטוי למתח כתב החיידק. TMD-Induced oligomerization גורם dimerization של ToxR, הפעלת שעתוק וייצור חלבונים הכתב,-galactosidase.
Abstract
התצוגה פשטני של תחומים הטרנסממברני חלבון רק עוגנים bilayers פוספוליפידים מכבר מופרכת. במקרים רבים קרום פורש חלבונים התפתחו מנגנונים מתוחכמים ביותר של פעולה. 1-3 דרך אחת שבה חלבונים בממברנה יכולים לווסת את המבנים שלהם פונקציות היא על ידי מגע ישיר וספציפי של סלילים הידרופובי, להרכיב oligomers הטרנסממברני מובנים. 4,5 האחרונות הרבה העבודה התמקדה הפצה של חומצות אמינו נמצאו מועדף בהשוואה בתמיסה מימית לבין כוחות מולקולאריים שונים חלבון כונן העמותה. 6,7 עם זאת, מחקרים של הכרה מולקולרית בבית תחום הטרנסממברני של חלבונים עדיין מפגרת אלה בסביבת קרום מסיס במים אזורים. המכשול העיקרי שנותר: למרות הספציפיות מדהים זיקה כי oligomerization הטרנסממברני יכולים להשיג, 8 מדידה ישירה של הקשר שלהם הוא מאתגר. מתודולוגיות מסורתית להחיל ללמוד את תפקוד הממברנה נפרד חלבון יכול להיות הקשו על ידי שבחוסר הטבועה של רצפים תחת בחינה. תובנות Biophysical זכה ללמוד פפטידים סינתטיים המייצגים תחומים הטרנסממברני יכול לספק תובנה מבניים שימושי. עם זאת, הרלוונטיות הביולוגית של micellar את חומר הניקוי או מערכות liposome שימוש במחקרים אלה לחקות ממברנות הסלולר מוטלת בספק לעתים קרובות, לעשות פפטידים לאמץ מבנה יליד דמוי בתנאים אלה ועושה התנהגות פונקציונלי שלהם באמת משקפים את מצב הפעולה בתוך קרום יליד ? כדי ללמוד את יחסי הגומלין של רצפי הטרנסממברני ב bilayers פוספוליפידים טבעיים, פיתחה את מבחני המעבדה Langosch ToxR כתב תעתיק. 9 תחום הטרנסממברני עניין מבוטא חלבון כימרי עם חלבון מחייב מלטוז עבור מיקום periplasm ו ToxR לספק דו"ח רמת oligomerization (איור 1).
בעשור האחרון, קבוצות אחרות (למשל אנגלמן, דגראדו, שי) אופטימיזציה נוספת ויישומי assay זה כתב ToxR. 10-13 מבחני ToxR שונים הפכו להיות תקן הזהב לבחון חלבונים אינטראקציות קרום התא. אנחנו כאן להדגים פעולה ניסיוני טיפוסי שנערך במעבדה שלנו בעיקר כדלקמן פרוטוקולים שפותחו על ידי Langosch. שיטה זו החלה בדרך כלל שימושי ניתוח של תחום העמותה עצמית הטרנסממברני ב E. coli, שבו β-galactosidase ייצור משמש כדי להעריך את הנטייה oligomerization TMD. עם dimerization TMD-Induced, ToxR נקשר האמרגן ctx גרימת עד ויסות של הגן LacZ עבור galactosidase-β. Readout colorimetric מתקבל על ידי תוספת של ONPG לתאי lyzed. מחשוף hydrolytic של ONPG ידי β-galactosidase תוצאות בייצור של המינים קליטת אור O-nitrophenolate (ONP) (איור 2).
Protocol
Discussion
Assay כתב תעתיק ToxR היא דרך קליל לזהות רצפי הטרנסממברני עם פוטנציאל oligomerize. מאז האינטראקציות מתרחשות בתוך הקרום הפנימי חיידקי, assay זה עוקף את הנושאים הקשורים תוקפו של מערכות הלומדים קרום כוזב סביבות. בהתחשב בכך שיבוט של TMDS מרובים לתוך פלסמיד אחד יכול בקלות להתבצע במקביל a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים המכונים הלאומיים לבריאות (1R21CA138373 ואת לעמוד סרטן (SU2C) עבור תומך הכספיים של עבודה זו. ח.י. היא אסירת תודה על פרס 2009 עליון מן האגודה האמריקאית לחקר הסרטן, פרס המלומד קימל מן סידני קימל קרן לחקר הסרטן (SKF-08-101), ואת הקרן הלאומית למדע הקריירה המוקדמת הפקולטה פרס (NSF0954819).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| BamHI restriction enzyme | Invitrogen | 15201023 | Invitrogen enzymes were found to be more efficient than alternative suppliers |
| NheI restriction enzyme | Invitrogen | 15444011 | Invitrogen enzymes were found to be more efficient than alternative suppliers |
| 15 mL culture tubes | Fisher Scientific | 14-956-1J | |
| SOC media | Teknova | S0225 | Made up to the appropriate volume and sterilized by autoclaving. |
| LB media | Sigma-Aldrich | L7275 | Made up to the appropriate volume and sterilized by autoclaving. |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | CO378 | Stock solution of 30 mg/ mL in ethanol stored in freezer |
| Arabinose | Fluka | 10839 | Stock solution of 2.5% (w/v) in water stored in freezer |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| KCl | Mallinckrodt Chemicals | 6858-06 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 63138 | |
| Sodium dodecylsulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| 2-Nitrophenyl β-D-galactopyranoside (ONPG) | Sigma-Aldrich | 73660 | |
| Z-buffer | 16.1 g Na2HPO4 5.5g NaH2PO4 0.75g KCl 0.246g MgSO4 Make up to 1 l, pH 7.0 |
||
| Z-buffer/chloroform | 200 mL β-mercaptoethanol, 2 mL chloroform, make up to 20 mL with Z-buffer. Vortex for 1 min, centrifuge for 1 min at 800 rpm. Make fresh for each plate. | ||
| Z-buffer/SDS | 160 mg SDS dissolved in 10 mL Z-buffer | ||
| Z-buffer/ONPG | 40 mg ONPG in 10 mL Z-buffer. Make fresh for each plate | ||
| β-mercaptoethanol | Calbiochem | 444203 | |
| Anti-MBP monoclonal antibody (HRP conjugated) | NEB | E8038S | |
| Minimal media with maltose | 1 x M9 salts, 0.4% maltose, 1 mg/ mL thiamin, 2 mM MgSO4 | ||
| 96-well flat bottom plate | Sarstedt | 83.1835.300 | |
| Plate-reader | Beckman Coulter | DTX880 Multimode Detector | |
| Water bath | VWRI | 89032-204 | |
| Shaking incubator | FormaScientific |
References
- Parker, M. S. Oligomerization of the heptahelical G protein coupling receptors: a case for association using transmembrane helices. Mini Rev Med Chem. 9, 329-339 (2009).
- Mo, W., Zhang, J. T. Oligomerization of human ATP-binding cassette transporters and its potential significance in human disease. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5, 1049-1063 (2009).
- von Heijne, G. Membrane-protein topology. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 909-918 (2006).
- Van Horn, W. D. Solution nuclear magnetic resonance structure of membrane-integral diacylglycerol kinase. Science. 324, 1726-1729 (2009).
- Hattori, M. Mg(2+)-dependent gating of bacterial MgtE channel underlies Mg(2+) homeostasis. Embo J. 28, 3602-3612 (2009).
- Ulmschneider, M. B., Sansom, M. S. Amino acid distributions in integral membrane protein structures. Biochim Biophys Acta. 1512, 1-14 (2001).
- Deber, C. M., Goto, N. K. Folding proteins into membranes. Nat Struct Biol. 3, 815-818 (1996).
- Gerber, D., Shai, Y. In vivo detection of hetero-association of glycophorin-A and its mutants within the membrane. J Biol Chem. 276, 31229-31232 (2001).
- Langosch, D., Brosig, B., Kolmar, H. p., Fritz, H. J. Dimerisation of the glycophorin A transmembrane segment in membranes probed with the ToxR transcription activator. J Mol Biol. 263, 525-530 (1996).
- Russ, W. P., Engelman, D. M. TOXCAT: a measure of transmembrane helix association in a biological membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 863-868 (1999).
- Berger, B. W. Consensus motif for integrin transmembrane helix association. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 703-708 (2010).
- Oates, J., King, G., Dixon, A. M. Strong oligomerization behavior of PDGFbeta receptor transmembrane domain and its regulation by the juxtamembrane regions. Biochim Biophys Acta. 1798, 605-615 (2010).
- Sal-Man, N., Gerber, D., Shai, Y. Hetero-assembly between all-L- and all-D-amino acid transmembrane domains: forces involved and implication for inactivation of membrane proteins. J Mol Biol. 344, 855-864 (2004).
- Sammond, D. W. Transmembrane peptides used to investigate the homo-oligomeric interface and binding hot-spot of the oncogene, latent membrane protein 1. , (2010).
- Li, R. Dimerization of the transmembrane domain of Integrin alphaIIb subunit in cell membranes. J Biol Chem. 279, 26666-26673 (2004).
- Ruan, W., Becker, V., Klingmuller, U., Langosch, D. The interface between self-assembling erythropoietin receptor transmembrane segments corresponds to a membrane-spanning leucine zipper. J Biol Chem. 279, 3273-3279 (2004).
- Finger, C., Escher, C., Schneider, D. The single transmembrane domains of human receptor tyrosine kinases encode self-interactions. Sci Signal. 2, ra56-ra56 (2009).
