ToxR Assay tarafından belirlenen Transmembran Domain Oligomerization Eğilimi
Summary
Tek-geçişli transmembran etki oligomerization eğilimi (TMDS) değerlendirmek için etkili bir prosedür açıklanmıştır. E. coli muhabiri zorlanma ToxR için erimiş TMD oluşan Kimerik proteinleri ifade edilir. TMD-kaynaklı oligomerization ToxR, transkripsiyon ve muhabir protein üretimi,-galaktosidaz aktivasyonu dimerization neden olur.
Abstract
Çürütülmüştür beri protein transmembran etki basitleştirilmiş görünüm olarak sadece fosfolipid bilayers çapa uzun. Birçok durumda membran kapsayan proteinler eylem oldukça sofistike mekanizmaları gelişmiştir. Membran proteinleri, yapıları ve işlevleri modüle 1-3 hangi bir yolu yapılandırılmış transmembran oligomerler oluşturan, hidrofobik heliksler ve özel direkt temas 4,5 Kadar son tercihen sulu çözelti ve sürücü protein dernek. 6,7 Bununla birlikte, transmembran proteinlerinin etki moleküler tanıma çalışmaları hala gerisinde kalıyor bu farklı moleküller arası kuvvetler karşılaştırma membran ortamda bulunan amino asitlerin dağıtım odaklandı suda çözünen bölgeler. Büyük bir engel kalır: transmembran oligomerization elde edebilirsiniz olağanüstü spesifite ve afinite rağmen, kendi dernek 8 doğrudan ölçümü zordur. Integral membran proteini fonksiyon çalışmaya uygulanan geleneksel metodolojiler inceleme altında dizilerinin doğasında çıkılmazlık engel olabilir. Transmembran etki alanlarını temsil eden sentetik peptidlerin inceleyerek elde Biyofiziksel anlayışlar yararlı yapısal içgörü sağlayabilir. Ancak, deterjan misel veya hücre zarının taklit etmek için bu çalışmalarda kullanılan lipozom sistemleri biyolojik önemi sık sık sorgulanmaktadır; peptidler, bu koşullar altında anadili gibi bir yapı benimsiyor ve bunların fonksiyonel davranış, gerçekten yerli bir membran içinde eylem türü yansıtıyor mu ? Transmembran dizilerinin doğal fosfolipid bilayers etkileşimleri incelemek üzere, Langosch laboratuar ToxR transkripsiyonel muhabiri deneyleri geliştirdi. 9 transmembran ilgi alanı periplasm ve ToxR konumu, maltoz bağlayıcı protein ile bir kimerik protein olarak ifade edilir bir rapor sunmak oligomerization düzeyi (Şekil 1).
Son on yıl içinde, diğer bazı gruplar (örneğin Engelman, DeGrado, Shai) daha da optimize ve bu ToxR muhabiri tahlil uygulanan 10-13 çeşitli ToxR deneyleri, hücre zarlarında protein-protein etkileşimleri test etmek için bir altın standart haline gelmiştir . Biz burada öncelikle Langosch tarafından geliştirilen protokoller aşağıdaki laboratuvarda yapılan tipik bir deneysel çalışma göstermektedir. Bu genellikle uygulanan yöntem E. transmembran alan öz-dernek analizi için yararlı coli, β-galaktosidaz üretim TMD oligomerization eğilimi değerlendirmek için kullanılır. TMD indüklenen dimerization üzerine, ToxR β-galaktosidaz LacZ gen up-regülasyonu neden ctx organizatörü bağlar. Kolorimetrik okuma kazandaki süreçlerin hücreleri ONPG eklenmesi ile elde edilir. Işık emici türleri o nitrophenolate (ONP) (Şekil 2) üretimini β-galaktosidaz sonuçları ONPG hidrolitik bölünme.
Protocol
Discussion
ToxR transkripsiyonel muhabiri tahlil oligomerize potansiyeline sahip transmembran dizileri tanımlamak için uyduruk bir yoludur. Bakteriyel iç zarı içinde meydana gelen etkileşimler olduğundan, bu testte membran-mimetik ortamlarda eğitim sistemlerinin geçerliliği ile ilgili konular circumvents. Paralel olarak tek bir plazmid birden çok TMDS klonlama kolayca yapılabilir ve tüm testi 96-plaka biçiminde yapılabilir göz önüne alındığında, bu testte yüksek verimlilik analizi için çok sayıda protein …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz, Ulusal Sağlık Enstitüleri (1R21CA138373 teşekkür ediyor ve bu çalışmanın finansal destek Kanseri (SU2C) Stand Up. HY, Amerikan Kanser Araştırma, Sidney Kimmel Vakfı Kimmel Scholar Ödülü Derneği, 2009 Elion Ödülü için minnettar Kanser Araştırma (SKF-08-101) ve Ulusal Bilim Vakfı Fakültesi Erken Kariyer Ödülü (NSF0954819).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| BamHI restriction enzyme | Invitrogen | 15201023 | Invitrogen enzymes were found to be more efficient than alternative suppliers |
| NheI restriction enzyme | Invitrogen | 15444011 | Invitrogen enzymes were found to be more efficient than alternative suppliers |
| 15 mL culture tubes | Fisher Scientific | 14-956-1J | |
| SOC media | Teknova | S0225 | Made up to the appropriate volume and sterilized by autoclaving. |
| LB media | Sigma-Aldrich | L7275 | Made up to the appropriate volume and sterilized by autoclaving. |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | CO378 | Stock solution of 30 mg/ mL in ethanol stored in freezer |
| Arabinose | Fluka | 10839 | Stock solution of 2.5% (w/v) in water stored in freezer |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| KCl | Mallinckrodt Chemicals | 6858-06 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 63138 | |
| Sodium dodecylsulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| 2-Nitrophenyl β-D-galactopyranoside (ONPG) | Sigma-Aldrich | 73660 | |
| Z-buffer | 16.1 g Na2HPO4 5.5g NaH2PO4 0.75g KCl 0.246g MgSO4 Make up to 1 l, pH 7.0 |
||
| Z-buffer/chloroform | 200 mL β-mercaptoethanol, 2 mL chloroform, make up to 20 mL with Z-buffer. Vortex for 1 min, centrifuge for 1 min at 800 rpm. Make fresh for each plate. | ||
| Z-buffer/SDS | 160 mg SDS dissolved in 10 mL Z-buffer | ||
| Z-buffer/ONPG | 40 mg ONPG in 10 mL Z-buffer. Make fresh for each plate | ||
| β-mercaptoethanol | Calbiochem | 444203 | |
| Anti-MBP monoclonal antibody (HRP conjugated) | NEB | E8038S | |
| Minimal media with maltose | 1 x M9 salts, 0.4% maltose, 1 mg/ mL thiamin, 2 mM MgSO4 | ||
| 96-well flat bottom plate | Sarstedt | 83.1835.300 | |
| Plate-reader | Beckman Coulter | DTX880 Multimode Detector | |
| Water bath | VWRI | 89032-204 | |
| Shaking incubator | FormaScientific |
References
- Parker, M. S. Oligomerization of the heptahelical G protein coupling receptors: a case for association using transmembrane helices. Mini Rev Med Chem. 9, 329-339 (2009).
- Mo, W., Zhang, J. T. Oligomerization of human ATP-binding cassette transporters and its potential significance in human disease. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5, 1049-1063 (2009).
- von Heijne, G. Membrane-protein topology. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 909-918 (2006).
- Van Horn, W. D. Solution nuclear magnetic resonance structure of membrane-integral diacylglycerol kinase. Science. 324, 1726-1729 (2009).
- Hattori, M. Mg(2+)-dependent gating of bacterial MgtE channel underlies Mg(2+) homeostasis. Embo J. 28, 3602-3612 (2009).
- Ulmschneider, M. B., Sansom, M. S. Amino acid distributions in integral membrane protein structures. Biochim Biophys Acta. 1512, 1-14 (2001).
- Deber, C. M., Goto, N. K. Folding proteins into membranes. Nat Struct Biol. 3, 815-818 (1996).
- Gerber, D., Shai, Y. In vivo detection of hetero-association of glycophorin-A and its mutants within the membrane. J Biol Chem. 276, 31229-31232 (2001).
- Langosch, D., Brosig, B., Kolmar, H. p., Fritz, H. J. Dimerisation of the glycophorin A transmembrane segment in membranes probed with the ToxR transcription activator. J Mol Biol. 263, 525-530 (1996).
- Russ, W. P., Engelman, D. M. TOXCAT: a measure of transmembrane helix association in a biological membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 863-868 (1999).
- Berger, B. W. Consensus motif for integrin transmembrane helix association. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 703-708 (2010).
- Oates, J., King, G., Dixon, A. M. Strong oligomerization behavior of PDGFbeta receptor transmembrane domain and its regulation by the juxtamembrane regions. Biochim Biophys Acta. 1798, 605-615 (2010).
- Sal-Man, N., Gerber, D., Shai, Y. Hetero-assembly between all-L- and all-D-amino acid transmembrane domains: forces involved and implication for inactivation of membrane proteins. J Mol Biol. 344, 855-864 (2004).
- Sammond, D. W. Transmembrane peptides used to investigate the homo-oligomeric interface and binding hot-spot of the oncogene, latent membrane protein 1. , (2010).
- Li, R. Dimerization of the transmembrane domain of Integrin alphaIIb subunit in cell membranes. J Biol Chem. 279, 26666-26673 (2004).
- Ruan, W., Becker, V., Klingmuller, U., Langosch, D. The interface between self-assembling erythropoietin receptor transmembrane segments corresponds to a membrane-spanning leucine zipper. J Biol Chem. 279, 3273-3279 (2004).
- Finger, C., Escher, C., Schneider, D. The single transmembrane domains of human receptor tyrosine kinases encode self-interactions. Sci Signal. 2, ra56-ra56 (2009).
