הפעלה של אפופטוזיס על ידי Microinjection cytoplasmic של ציטוכרום ג</em
Summary
בפרוטוקול זה, אנו מתארים את microinjection cytoplasmic ישירה של ציטוכרום<em> ג</em> החלבונים לתוך fibroblasts ונוירונים אוהד העיקרי. טכניקה זו מאפשרת המבוא של ציטוכרום<em> ג</em> החלבונים לתוך הציטופלסמה של תאים מחקה את שחרורו של ציטוכרום<em> ג</em> מן המיטוכונדריה, אשר מתרחשת במהלך אפופטוזיס.
Abstract
אפופטוזיס או מות תאים מתוכנת, הוא מסלול שימור פיקוח הדוק שבאמצעותם תאים מתים 1. אפופטוזיס יכול להיות מופעלות כאשר תאים המפגש מגוון רחב של מדגיש ציטוטוקסיות. עלבונות אלה ליזום מפלי איתות כי בסופו של דבר לגרום לשחרור ציטוכרום C מהחלל intermembrane המיטוכונדרי אל הציטופלסמה 2. שחרורו של ציטוכרום C מתוך המיטוכונדריה היא אירוע שמפעיל את מפתח ההפעלה המהירה של caspases, פרוטאזות הסלולר המפתח אשר בסופו של דבר לפועל מוות של תאים 3-4.
מסלול של אפופטוזיס מוסדר בנקודות במורד הזרם של שחרור ציטוכרום C מתוך המיטוכונדריה 5. על מנת ללמוד את תקנה שלאחר המיטוכונדרי של הפעלת caspase, חוקרים רבים פנו microinjection cytoplasmic ישירה של holocytochrome ג (heme המצורפת) חלבונים לתוך התאים 6-9. ציטוכרום C הוא מקומי בדרך כלל המיטוכונדריה שם הקובץ המצורף של קבוצת heme הוא הכרחי כדי לאפשר לה להפעיל אפופטוזיס 10-11. לכן, כדי להפעיל ישירות caspases, יש צורך להזריק את החלבון holocytochrome ג במקום cDNA שלו, כי בעוד ביטוי של ציטוכרום C מתוך בונה cDNA תגרום המיקוד ואת המיטוכונדריה מצורף heme, זה יהיה מוחרם מ caspases cytosolic. לפיכך, microinjection cytosolic ישירה של חלבון מטוהרים heme המצורפת ג ציטוכרום הוא כלי שימושי לחקות לשחרר המיטוכונדריאלי ציטוכרום C ו אפופטוזיס ללא שימוש עלבונות רעילים אשר גורמים נזק הסלולר המיטוכונדריה.
במאמר זה, אנו מתארים שיטה microinjection של החלבון ציטוכרום C לתוך התאים, באמצעות העכבר fibroblasts עובריים (MEFs) ו נוירונים אוהד העיקרי כדוגמאות. בעוד פרוטוקול זה מתמקד הזרקה של ג ציטוכרום לחקירות של אפופטוזיס, טכניקות המוצג כאן ניתן להתאים בקלות עבור microinjection של חלבונים אחרים בעלי עניין.
Protocol
Discussion
Microinjection של ציטוכרום C ישירות לתוך הציטופלסמה של תאים הוא כלי ייחודי ורב עוצמה המאפשר ללימודי תקנה שלאחר המיטוכונדרי של אפופטוזיס. חשוב לציין, טכניקה זו מאפשרת הפעלה ישירה של הזרם אפופטוזיס של המיטוכונדריה ללא שימוש בחומרים אשר גורמים נזק הסלולר או המיטוכונדריה…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIH כדי להעניק NS042197 MD. AJK נתמך על ידי מענקים T32GM008719 ו F30NS068006.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| DM IRE2 Inverted Microscope | Leica | ||
| PC-10 Microinjection Needle Puller | Narishige | ||
| MWO-202 Micromanipulator | Narishige | ||
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | ||
| Thin-wall Boroscilicate Capillary Glass with Microfilament | A-M Systems | 615000 | 4 inch length, 1.00 mm outer diameter, 0.75 mm inner diameter |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | Average molecular weight ~70,000 Da |
| Bovine Cytochrome c Protein | Sigma-Aldrich | C3131 |
Referências
- Danial, N. N., Korsmeyer, S. J. Cell death: critical control points. Cell. 116, 205-219 (2004).
- Wang, X. The expanding role of mitochondria in apoptosis. Genes Dev. 15, 2922-2933 (2001).
- Hengartner, M. O. The biochemistry of apoptosis. Nature. 407, 770-776 (2000).
- Fuentes-Prior, P., Salvesen, G. S. The protein structures that shape caspase activity, specificity, activation and inhibition. Biochem. J. 384, 201-232 (2004).
- Tait, S. W., Green, D. R. Mitochondria and cell death: outer membrane permeabilization and beyond. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 621-632 (2010).
- Brustugun, O. T., Fladmark, K. E., Doskeland, S. O., Orrenius, S., Zhivotovsky, B. Apoptosis induced by microinjection of cytochrome c is caspase-dependent and is inhibited by Bcl-2. Cell Death Differ. 5, 660-668 (1998).
- Li, F. Cell-specific induction of apoptosis by microinjection of cytochrome c. Bcl-XL has activity independent of cytochrome c release. J. Biol. Chem. 272, 30299-30305 (1997).
- Deshmukh, M., Johnson, E. M. Evidence of a novel event during neuronal death: development of competence-to-die in response to cytoplasmic cytochrome c. Neuron. 21, 695-705 (1998).
- Vaughn, A. E., Deshmukh, M. Glucose metabolism inhibits apoptosis in neurons and cancer cells by redox inactivation of cytochrome c. Nat. Cell Biol. 10, 1477-1483 (2008).
- Yang, J. Prevention of apoptosis by Bcl-2: release of cytochrome c from mitochondria blocked. Science. 275, 1129-1132 (1997).
- Gonzales, D. H., Neupert, W. Biogenesis of mitochondrial c-type cytochromes. J Bioenerg Biomembr. 22, 753-768 (1990).
- Ellerby, H. M. Establishment of a cell-free system of neuronal apoptosis – comparison of premitochondrial, mitochondrial, and postmitochondrial phases. J. Neurosci. 17, 6165-6178 (1997).
- Neame, S. J., Rubin, L. L., Philpott, K. L. Blocking cytochrome c activity within intact neurons inhibits apoptosis. J. Cell Biol. 142, 1583-1593 (1998).
- Potts, P. R., Singh, S., Knezek, M., Thompson, C. B., Deshmukh, M. Critical function of endogenous XIAP in regulating caspase activation during sympathetic neuronal apoptosis. J. Cell Biol. 163, 789-799 (2003).
- Estus, S. Altered gene expression in neurons during programmed cell death: identification of c-jun as necessary for neuronal apoptosis. J. Cell Biol. 127, 1717-1727 (1994).
