激活细胞凋亡的细胞色素的细胞质显微注射 C</em
Summary
在这个协议中，我们描述直接胞浆内显微注射细胞色素<em> C</em>蛋白的成纤维母细胞和初级交感神经元。这种技术可以引进的细胞色素<em> C</em>蛋白进入细胞的细胞质和模仿释放细胞色素<em> C</em>从线粒体，细胞凋亡过程中发生。
Abstract
凋亡或程序性细胞死亡，是一个保守的和高度管制的途径，其中的细胞死亡 ， 1。可以触发细胞凋亡的细胞时遇到一个广泛的细胞毒性强调。这些侮辱启动信号级联反应，最终导致细胞色素 C从线粒体intermembrane空间释放到细胞质2。细胞色素 C从线粒体释放，是一个关键的事件触发迅速激活caspases的，关键的细胞蛋白酶，其最终执行细胞死亡3-4。
细胞凋亡通路是调节细胞色素 C从线粒体释放5点的上游和下游。为了研究线粒体调节caspase活化后，许多研究者纷纷转向直接holocytochrome C（血红素附后）蛋白质进入细胞6-9的胞浆内显微注射。细胞色素 c通常是本地化的线粒体一个血红素组的附件是必要的，使其能够激活细胞凋亡 10-11 。因此，直接激活caspases的，这是必要的，因为细胞色素 C的基因结构表达，而将导致线粒体定位和血红素附件，它将会从胞质caspases的螯合注入holocytochrome C蛋白，而不是其cDNA。因此，直接附加纯化的血红素细胞色素C蛋白的胞浆内显微注射是一个有用的工具，以模仿不使用造成细胞线粒体损伤的有毒侮辱的线粒体细胞色素C释放和凋亡。
在这篇文章中，我们描述了细胞色素 c蛋白进入细胞的显微注射的方法，用小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）和主要交感神经元作为例子。虽然这个协议对细胞色素 C注射液对细胞凋亡的调查重点，这里显示的技术也可以很容易地适应注射其他感兴趣的蛋白质。
Protocol
Discussion
直接进入细胞胞浆内显微注射细胞色素 C是一种独特而强大的的工具，它允许后线粒体调控细胞凋亡的研究。更重要的是，这种技术可以让没有使用导致细胞或线粒体损伤的代理的直接激活线粒体凋亡下游。
虽然这个协议对微量注射细胞色素 C对细胞凋亡的研究重点，这里显示的蛋白质显微注射法的一般原则也可以用于其他感兴趣的蛋白质。例如，一些研究者已?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由美国国立卫生研究院授予NS042197到MD支持。 AJK支持补助T32GM008719和F30NS068006。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| DM IRE2 Inverted Microscope | Leica | ||
| PC-10 Microinjection Needle Puller | Narishige | ||
| MWO-202 Micromanipulator | Narishige | ||
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | ||
| Thin-wall Boroscilicate Capillary Glass with Microfilament | A-M Systems | 615000 | 4 inch length, 1.00 mm outer diameter, 0.75 mm inner diameter |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | Average molecular weight ~70,000 Da |
| Bovine Cytochrome c Protein | Sigma-Aldrich | C3131 |
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