Activering van apoptose door Cytoplasmatische micro-injectie van Cytochroom C</em
Summary
In dit protocol beschrijven we de directe cytoplasmatische micro-injectie van cytochroom<em> C</em> Eiwit in fibroblasten en primaire sympathische neuronen. Deze techniek maakt het voor de invoering van cytochroom<em> C</em> Eiwit in het cytoplasma van cellen en bootst de afgifte van cytochroom<em> C</em> Van de mitochondriën, die optreedt tijdens apoptose.
Abstract
Apoptose of geprogrammeerde celdood, is een geconserveerd en sterk gereguleerd weg waardoor cellen sterven 1. Apoptose kan worden geactiveerd wanneer cellen geconfronteerd met een breed scala aan cytotoxische spanningen. Deze beledigingen starten signaleringscascades die uiteindelijk leiden tot het vrijkomen van cytochroom c van het mitochondriale intermembrane ruimte om het cytoplasma 2. Het vrijkomen van cytochroom C van mitochondriën is een belangrijke gebeurtenis dat de snelle activatie van caspases, de belangrijkste cellulaire proteasen die uiteindelijk uit te voeren celdood 3-4 triggers.
De route van apoptose is geregeld op punten stroomopwaarts en stroomafwaarts van cytochroom c vrijlating uit de mitochondriën 5. Om de post-mitochondriale regulering van caspase activatie studie, hebben veel onderzoekers zich tot de directe cytoplasmatische micro-injectie van holocytochrome c (heem-ingeschrevenen) eiwit in cellen 6-9. Cytochroom c is normaal gelokaliseerd in de mitochondriën, waar bevestiging van een heem groep is nodig om het te activeren apoptose 10-11. Daarom direct te activeren caspases, is het noodzakelijk om de holocytochrome c eiwit in plaats van de cDNA injecteren, want terwijl de expressie van cytochroom c van cDNA constructen zal resulteren in het mitochondriaal targeting en heem gehechtheid, het zal worden afgezonderd van de cytosolische caspases. Zo is de directe cytosolische micro-injectie van gezuiverd heem-aangesloten cytochroom c-eiwit is een nuttig hulpmiddel om mitochondriaal cytochroom c vrij te laten en apoptose na te bootsen, zonder het gebruik van giftige beledigingen welk cellulair en mitochondriale schade veroorzaken.
In dit artikel beschrijven we een methode voor de micro-injectie van cytochroom c eiwitten in de cellen, met behulp van muis embryonale fibroblasten (MEF) en primaire sympathische neuronen als voorbeelden. Terwijl dit protocol richt zich op de injectie van cytochroom c voor onderzoeken van apoptose, kan de technieken die hier getoond ook gemakkelijk worden aangepast voor micro-injectie van andere eiwitten van belang.
Protocol
Discussion
De micro-injectie van cytochroom c direct in het cytoplasma van cellen is een unieke en krachtige tool die het mogelijk maakt voor studies van de post-mitochondriale regulatie van apoptose. Belangrijk is dat deze techniek maakt het mogelijk om directe activatie van apoptose stroomafwaarts van mitochondria, zonder het gebruik van middelen die cellulaire of mitochondriale schade veroorzaken.
Hoewel dit protocol is gericht op micro-injectie van cytochroom c voor studies over a…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie NS042197 aan MD. AJK werd ondersteund door subsidies T32GM008719 en F30NS068006.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| DM IRE2 Inverted Microscope | Leica | ||
| PC-10 Microinjection Needle Puller | Narishige | ||
| MWO-202 Micromanipulator | Narishige | ||
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | ||
| Thin-wall Boroscilicate Capillary Glass with Microfilament | A-M Systems | 615000 | 4 inch length, 1.00 mm outer diameter, 0.75 mm inner diameter |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | Average molecular weight ~70,000 Da |
| Bovine Cytochrome c Protein | Sigma-Aldrich | C3131 |
Referências
- Danial, N. N., Korsmeyer, S. J. Cell death: critical control points. Cell. 116, 205-219 (2004).
- Wang, X. The expanding role of mitochondria in apoptosis. Genes Dev. 15, 2922-2933 (2001).
- Hengartner, M. O. The biochemistry of apoptosis. Nature. 407, 770-776 (2000).
- Fuentes-Prior, P., Salvesen, G. S. The protein structures that shape caspase activity, specificity, activation and inhibition. Biochem. J. 384, 201-232 (2004).
- Tait, S. W., Green, D. R. Mitochondria and cell death: outer membrane permeabilization and beyond. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 621-632 (2010).
- Brustugun, O. T., Fladmark, K. E., Doskeland, S. O., Orrenius, S., Zhivotovsky, B. Apoptosis induced by microinjection of cytochrome c is caspase-dependent and is inhibited by Bcl-2. Cell Death Differ. 5, 660-668 (1998).
- Li, F. Cell-specific induction of apoptosis by microinjection of cytochrome c. Bcl-XL has activity independent of cytochrome c release. J. Biol. Chem. 272, 30299-30305 (1997).
- Deshmukh, M., Johnson, E. M. Evidence of a novel event during neuronal death: development of competence-to-die in response to cytoplasmic cytochrome c. Neuron. 21, 695-705 (1998).
- Vaughn, A. E., Deshmukh, M. Glucose metabolism inhibits apoptosis in neurons and cancer cells by redox inactivation of cytochrome c. Nat. Cell Biol. 10, 1477-1483 (2008).
- Yang, J. Prevention of apoptosis by Bcl-2: release of cytochrome c from mitochondria blocked. Science. 275, 1129-1132 (1997).
- Gonzales, D. H., Neupert, W. Biogenesis of mitochondrial c-type cytochromes. J Bioenerg Biomembr. 22, 753-768 (1990).
- Ellerby, H. M. Establishment of a cell-free system of neuronal apoptosis – comparison of premitochondrial, mitochondrial, and postmitochondrial phases. J. Neurosci. 17, 6165-6178 (1997).
- Neame, S. J., Rubin, L. L., Philpott, K. L. Blocking cytochrome c activity within intact neurons inhibits apoptosis. J. Cell Biol. 142, 1583-1593 (1998).
- Potts, P. R., Singh, S., Knezek, M., Thompson, C. B., Deshmukh, M. Critical function of endogenous XIAP in regulating caspase activation during sympathetic neuronal apoptosis. J. Cell Biol. 163, 789-799 (2003).
- Estus, S. Altered gene expression in neurons during programmed cell death: identification of c-jun as necessary for neuronal apoptosis. J. Cell Biol. 127, 1717-1727 (1994).
