Préparation de vie isolées cellules photoréceptrices vertébrés pour l'imagerie de fluorescence
Summary
Une méthode est décrite pour la préparation des cellules photoréceptrices de vie simple de différentes espèces de vertébrés pour l'imagerie de fluorescence. La méthode peut être utilisée pour l'image de la fluorescence des fluorophores endogènes, tels que le NADH ou la vitamine A, ou celle de manière exogène ajouté des colorants fluorescents sensibles à Ca<sup> 2 +</sup> Ou d'autres facteurs.
Abstract
Dans la rétine des vertébrés, phototransduction, la conversion de la lumière en un signal électrique, est effectué par la tige et le cône cellules photoréceptrices 1-4. Rod photorécepteurs sont responsables de la vision dans la pénombre, des cônes de lumière. Phototransduction prend place dans le segment externe de la cellule de photorécepteur, un compartiment spécialisé qui contient une forte concentration de pigment visuel, le détecteur de lumière primaire. Le pigment visuel est composé d'un chromophore, 11 – cis rétinal, attaché à une protéine, l'opsine. Un photon absorbé par le pigment visuel isomérise le chromophore de 11 – cis-trans. Cette photoisomérisation provoque un changement conformationnel dans le pigment visuel qui déclenche une cascade de réactions aboutissant à un changement dans le potentiel de membrane, et entraînant la transduction du stimulus lumineux en un signal électrique. La reprise de la cellule de la stimulation lumineuse implique la désactivation des intermédiaires activés par la lumière, et le rétablissement du potentiel de membrane. Ca 2 + module l'activité de plusieurs enzymes impliquées dans la phototransduction, et sa concentration est réduite lors de la stimulation lumineuse. De cette façon, le Ca 2 + joue un rôle important dans le rétablissement de la cellule de la stimulation lumineuse et son adaptation à la lumière de fond.
Une autre partie essentielle du processus de récupération est la régénération du pigment visuel qui a été détruit pendant la lumière de détection par le photoisomérisation de ses 11 – chromophore cis-trans 5-7. Cette régénération commence par la libération de tous les trans-rétinienne par le pigment photoactivé, laissant derrière lui l'opsine apo-protéines. Les libérés tout-trans rétinal est rapidement réduit dans une réaction en utilisant le NADPH au rétinol tout trans, et se combine avec l'opsine 11 frais – rétinien cis introduits dans le segment externe pour réformer le pigment visuel. Tous les trans-rétinol est alors transférée hors du segment externe et dans les cellules voisines par la protéine porteuse rétinoïdes Interphotoreceptor spécialisés de reliure (IRBP).
L'imagerie de fluorescence des cellules photoréceptrices unique peut être utilisée pour étudier leur physiologie et biologie cellulaire. Ca 2 + sensibles colorants fluorescents peuvent être utilisés pour examiner en détail l'interaction entre les segments externes Ca 2 + et les changements réponse à la lumière de 8 à 12 ainsi que le rôle du segment intérieur de Ca 2 + magasins dans l'homéostasie du Ca 2 + 13,14 . Les colorants fluorescents peuvent également être utilisés pour mesurer la concentration en Mg 2 + 15, le pH et comme traceurs de compartiments aqueux et la membrane 16. Enfin, la fluorescence intrinsèque des tout-trans rétinol (vitamine A) peuvent être utilisés pour suivre la cinétique de sa formation et l'élimination des cellules photoréceptrices seule 17-19.
Protocol
Discussion
Si la santé des cellules isolées ne sont pas obtenus, le problème réside soit avec l'isolement ou la santé de la rétine ou avec son hachage. Généralement, après avoir enlevé le devant de l'œil et le corps vitré, la rétine ascenseurs facilement hors de l'épithélium pigmentaire. Si ce n'est pas, essayez de le retirer à partir de la périphérie de l'œilleton. S'il est encore difficile de séparer, une possibilité probable est que l'animal n'a pas été adaptés à l'ob…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Soutenu par IEN octroi EY014850.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Dark room (100-150 ft2) | |||
| Red lights19 | Online stores | ||
| Infrared light sources and infrared image viewers | FJW Optical Systems, Inc. | ||
| Dissecting microscope19 | Outfitted with infrared viewers | ||
| Epifluorescence microscope enclosed in a light-tight cage19 | |||
| Dissecting tools (scissors, forceps, blade holder) | Roboz or Fine Science Tools | ||
| Sylgard elastomer | Essex (Charlotte, NC) | Sylgard 184 elastomer kit | |
| Poly-L-ornithine (0.01%) | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Poly-L-lysine (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | Dilute to 0.01% |
| Experimental chambers | Warner Instruments (Hamden, CT) | D3512P | |
| Petri dishes, plastic pipettes | Fisher Scientific |
Referências
- Burns, M. E., Arshavsky, V. Y. Beyond Counting Photons: Trials and Trends in Vertebrate Visual Transduction. Neuron. 48, 387-401 (2005).
- Ebrey, T., Koutalos, Y. Vertebrate Photoreceptors. Prog Retin Eye Res. 20, 49-94 (2001).
- Fain, G. L., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Koutalos, Y. Adaptation in Vertebrate Photoreceptors. Physiol Rev. 81, 117-151 (2001).
- Palczewski, K. G Protein-Coupled Receptor Rhodopsin. Annu Rev Biochem. 75, 743-767 (2006).
- Saari, J. C. Biochemistry of Visual Pigment Regeneration: The Friedenwald Lecture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41, 337-348 (2000).
- Lamb, T. D., Pugh, E. N. Dark Adaptation and the Retinoid Cycle of Vision. Prog Retin Eye Res. 23, 307-380 (2004).
- Imanishi, Y., Lodowski, K. H., Koutalos, Y. Two-Photon Microscopy: Shedding Light on the Chemistry of Vision. Bioquímica. 46, 9674-9684 (2007).
- Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Fain, G. L. Bleached Pigment Produces a Maintained Decrease in Outer Segment Ca2+ in Salamander Rods. J Gen Physiol. 111, 53-64 (1998).
- Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Bandarchi, J., Fain, G. L. Light-Dependent Changes in Outer Segment Free-Ca2+ Concentration in Salamander Cone Photoreceptors. J Gen Physiol. 113, 267-277 (1999).
- Woodruff, M. L., Sampath, A. P., Matthews, H. R., Krasnoperova, N. V., Lem, J., Fain, G. L. Measurement of Cytoplasmic Calcium Concentration in the Rods of Wild-Type and Transducin Knock-out Mice. J Physiol. 542, 843-854 (2002).
- Leung, Y. T., Fain, G. L., Matthews, H. R. Simultaneous Measurement of Current and Calcium in the Ultraviolet-Sensitive Cones of Zebrafish. J Physiol. 579, 15-27 (2007).
- Matthews, H. R., Fain, G. L. Laser Spot Confocal Technique to Measure Cytoplasmic Calcium Concentration in Photoreceptors. Methods Enzymol. 316, 146-163 (2000).
- Szikra, T., Cusato, K., Thoreson, W. B., Barabas, P., Bartoletti, T. M., Krizaj, D. Depletion of Calcium Stores Regulates Calcium Influx and Signal Transmission in Rod Photoreceptors. J Physiol. 586, 4859-4875 (2008).
- Krizaj, D., Copenhagen, D. R. Compartmentalization of Calcium Extrusion Mechanisms in the Outer and Inner Segments of Photoreceptors. Neuron. 21, 249-256 (1998).
- Chen, C., Nakatani, K., Koutalos, Y. Free Magnesium Concentration in Salamander Photoreceptor Outer Segments. J Physiol. 553, 125-135 (2003).
- Chen, C., Jiang, Y., Koutalos, Y. Dynamic Behavior of Rod Photoreceptor Disks. Biophys J. 83, 1403-1412 (2002).
- Tsina, E., Chen, C., Koutalos, Y., Ala-Laurila, P., Tsacopoulos, M., Wiggert, B., Crouch, R. K., Cornwall, M. C. Physiological and Microfluorometric Studies of Reduction and Clearance of Retinal in Bleached Rod Photoreceptors. J Gen Physiol. 124, 429-443 (2004).
- Ala-Laurila, P., Kolesnikov, A. V., Crouch, R. K., Tsina, E., Shukolyukov, S. A., Govardovskii, V. I., Koutalos, Y., Wiggert, B., Estevez, M. E., Cornwall, M. C. Visual Cycle: Dependence of Retinol Production and Removal on Photoproduct Decay and Cell Morphology. J Gen Physiol. 128, 153-169 (2006).
- Koutalos, Y., Cornwall, M. C. Microfluorometric Measurement of the Formation of All-Trans-Retinol in the Outer Segments of Single Isolated Vertebrate Photoreceptors. Methods Mol Biol. 652, 129-147 (2010).
- Wu, Q., Blakeley, L. R., Cornwall, M. C., Crouch, R. K., Wiggert, B. N., Koutalos, Y. Interphotoreceptor Retinoid-Binding Protein Is the Physiologically Relevant Carrier That Removes Retinol from Rod Photoreceptor Outer Segments. Bioquímica. 46, 8669-8679 (2007).
- Kolesnikov, A. V., Ala-Laurila, P., Shukolyukov, S. A., Crouch, R. K., Wiggert, B., Estevez, M. E., Govardovskii, V. I., Cornwall, M. C. Visual Cycle and Its Metabolic Support in Gecko Photoreceptors. Vision Res. 47, 363-374 (2007).
- Chen, C., Blakeley, L. R., Koutalos, Y. Formation of All-Trans Retinol after Visual Pigment Bleaching in Mouse Photoreceptors. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 3589-3595 (2009).
