De voorbereiding van de levens-geïsoleerde gewervelde fotoreceptorcellen voor fluorescentie beeldvorming
Summary
Een methode wordt beschreven voor de bereiding van de enkel levend fotoreceptorcellen van verschillende gewervelde soorten voor fluorescentie beeldvorming. De methode kan worden gebruikt om het imago van de fluorescentie van endogene fluoroforen, zoals NADH of vitamine A, of die van exogeen toegevoegde fluorescerende kleurstoffen gevoelig voor Ca<sup> 2 +</sup> Of andere factoren.
Abstract
In de gewervelde netvlies, is fototransductie, de omzetting van licht naar een elektrisch signaal, uitgevoerd door de staafjes en kegeltjes lichtgevoelige cellen 1-4. Rod fotoreceptoren zijn verantwoordelijk voor het zicht bij weinig licht, kegels in fel licht. Fototransductie vindt plaats in de buitenste segment van de fotoreceptorcel, een gespecialiseerd vak dat een hoge concentratie van visuele pigment, de primaire lichtdetector bevat. De visuele pigment bestaat uit een chromofoor, 11 – cis netvlies, bevestigd aan een eiwit, opsin. Een foton geabsorbeerd door het visuele pigment isomerizes de chromofoor van 11 – cis naar all-trans. Dit photoisomerization brengt een conformationele verandering in het visuele pigment dat een cascade van reacties afgesloten met een verandering in de membraan potentiaal, en het bewerkstelligen van de transductie van het licht stimulans om een elektrisch signaal initieert. Het herstel van de cel van lichte stimulatie betreft het uitschakelen van de tussenproducten geactiveerd door licht, en het herstel van de membraanpotentiaal. Ca 2 + moduleert de werking van een aantal van de enzymen die betrokken zijn bij fototransductie, en de concentratie is verminderd op licht stimulatie. Op deze manier, Ca 2 + speelt een belangrijke rol bij het herstel van de cel van lichte prikkeling en de aanpassing ervan aan achtergrond licht.
Een ander essentieel onderdeel van het herstelproces is de regeneratie van het visuele pigment dat is tijdens de licht-detectie verwoest door de photoisomerization van de 11 – cis chromofoor naar all-trans 5-7. Deze regeneratie begint met de introductie van all-trans retinal door de gefotoactiveerd pigment, met achterlating van de apo-eiwit opsin. De vrijgekomen all-trans retinal wordt snel gereduceerd in een reactie gebruik te maken van NADPH naar all-trans retinol, en opsin combineert met verse 11 – cis retinal gebracht in het buitenste segment om de visuele pigment hervorming. All-trans retinol wordt dan overgebracht uit het buitenste segment en in de aangrenzende cellen door de gespecialiseerde maatschappij Interphotoreceptor retinoïde Binding Protein (IRBP).
Fluorescentie beeldvorming van enkele fotoreceptorcellen kunnen worden gebruikt om hun fysiologie en celbiologie studeren. Ca 2 +-gevoelige fluorescente kleurstoffen kunnen gebruikt worden in detail te onderzoeken het samenspel tussen de buitenste segment Ca 2 + veranderingen en de reactie op 8-12, alsook de rol van de binnenste segment Ca 2 +-winkels in Ca 2 + licht homeostase 13,14 . Fluorescente kleurstoffen kunnen ook worden gebruikt voor het meten van Mg 2 + concentratie 15, pH, en als tracers van waterige en membraan compartimenten 16. Tot slot kan de intrinsieke fluorescentie van all-trans retinol (vitamine A) worden gebruikt om de kinetiek van zijn vorming en verwijdering in enkele fotoreceptorcellen 17-19 te controleren.
Protocol
Discussion
Als gezonde geïsoleerde cellen zijn niet verkregen, ligt het probleem niet met de isolatie of de gezondheid van het netvlies of met haar hakken. Typisch, na het verwijderen van de voorkant van het oog en het glasvocht, het netvlies liften gemakkelijk uit het pigment epitheel. Als dit niet gebeurt, probeer dan te pellen het af te rekenen vanaf de periferie van de oogschelp. Als het nog steeds moeilijk te scheiden, een waarschijnlijke mogelijkheid is dat het dier niet is donker aangepast voor een ruime periode van tijd, …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ondersteund door NEI verlenen EY014850.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Dark room (100-150 ft2) | |||
| Red lights19 | Online stores | ||
| Infrared light sources and infrared image viewers | FJW Optical Systems, Inc. | ||
| Dissecting microscope19 | Outfitted with infrared viewers | ||
| Epifluorescence microscope enclosed in a light-tight cage19 | |||
| Dissecting tools (scissors, forceps, blade holder) | Roboz or Fine Science Tools | ||
| Sylgard elastomer | Essex (Charlotte, NC) | Sylgard 184 elastomer kit | |
| Poly-L-ornithine (0.01%) | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Poly-L-lysine (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | Dilute to 0.01% |
| Experimental chambers | Warner Instruments (Hamden, CT) | D3512P | |
| Petri dishes, plastic pipettes | Fisher Scientific |
Referências
- Burns, M. E., Arshavsky, V. Y. Beyond Counting Photons: Trials and Trends in Vertebrate Visual Transduction. Neuron. 48, 387-401 (2005).
- Ebrey, T., Koutalos, Y. Vertebrate Photoreceptors. Prog Retin Eye Res. 20, 49-94 (2001).
- Fain, G. L., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Koutalos, Y. Adaptation in Vertebrate Photoreceptors. Physiol Rev. 81, 117-151 (2001).
- Palczewski, K. G Protein-Coupled Receptor Rhodopsin. Annu Rev Biochem. 75, 743-767 (2006).
- Saari, J. C. Biochemistry of Visual Pigment Regeneration: The Friedenwald Lecture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41, 337-348 (2000).
- Lamb, T. D., Pugh, E. N. Dark Adaptation and the Retinoid Cycle of Vision. Prog Retin Eye Res. 23, 307-380 (2004).
- Imanishi, Y., Lodowski, K. H., Koutalos, Y. Two-Photon Microscopy: Shedding Light on the Chemistry of Vision. Bioquímica. 46, 9674-9684 (2007).
- Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Fain, G. L. Bleached Pigment Produces a Maintained Decrease in Outer Segment Ca2+ in Salamander Rods. J Gen Physiol. 111, 53-64 (1998).
- Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Bandarchi, J., Fain, G. L. Light-Dependent Changes in Outer Segment Free-Ca2+ Concentration in Salamander Cone Photoreceptors. J Gen Physiol. 113, 267-277 (1999).
- Woodruff, M. L., Sampath, A. P., Matthews, H. R., Krasnoperova, N. V., Lem, J., Fain, G. L. Measurement of Cytoplasmic Calcium Concentration in the Rods of Wild-Type and Transducin Knock-out Mice. J Physiol. 542, 843-854 (2002).
- Leung, Y. T., Fain, G. L., Matthews, H. R. Simultaneous Measurement of Current and Calcium in the Ultraviolet-Sensitive Cones of Zebrafish. J Physiol. 579, 15-27 (2007).
- Matthews, H. R., Fain, G. L. Laser Spot Confocal Technique to Measure Cytoplasmic Calcium Concentration in Photoreceptors. Methods Enzymol. 316, 146-163 (2000).
- Szikra, T., Cusato, K., Thoreson, W. B., Barabas, P., Bartoletti, T. M., Krizaj, D. Depletion of Calcium Stores Regulates Calcium Influx and Signal Transmission in Rod Photoreceptors. J Physiol. 586, 4859-4875 (2008).
- Krizaj, D., Copenhagen, D. R. Compartmentalization of Calcium Extrusion Mechanisms in the Outer and Inner Segments of Photoreceptors. Neuron. 21, 249-256 (1998).
- Chen, C., Nakatani, K., Koutalos, Y. Free Magnesium Concentration in Salamander Photoreceptor Outer Segments. J Physiol. 553, 125-135 (2003).
- Chen, C., Jiang, Y., Koutalos, Y. Dynamic Behavior of Rod Photoreceptor Disks. Biophys J. 83, 1403-1412 (2002).
- Tsina, E., Chen, C., Koutalos, Y., Ala-Laurila, P., Tsacopoulos, M., Wiggert, B., Crouch, R. K., Cornwall, M. C. Physiological and Microfluorometric Studies of Reduction and Clearance of Retinal in Bleached Rod Photoreceptors. J Gen Physiol. 124, 429-443 (2004).
- Ala-Laurila, P., Kolesnikov, A. V., Crouch, R. K., Tsina, E., Shukolyukov, S. A., Govardovskii, V. I., Koutalos, Y., Wiggert, B., Estevez, M. E., Cornwall, M. C. Visual Cycle: Dependence of Retinol Production and Removal on Photoproduct Decay and Cell Morphology. J Gen Physiol. 128, 153-169 (2006).
- Koutalos, Y., Cornwall, M. C. Microfluorometric Measurement of the Formation of All-Trans-Retinol in the Outer Segments of Single Isolated Vertebrate Photoreceptors. Methods Mol Biol. 652, 129-147 (2010).
- Wu, Q., Blakeley, L. R., Cornwall, M. C., Crouch, R. K., Wiggert, B. N., Koutalos, Y. Interphotoreceptor Retinoid-Binding Protein Is the Physiologically Relevant Carrier That Removes Retinol from Rod Photoreceptor Outer Segments. Bioquímica. 46, 8669-8679 (2007).
- Kolesnikov, A. V., Ala-Laurila, P., Shukolyukov, S. A., Crouch, R. K., Wiggert, B., Estevez, M. E., Govardovskii, V. I., Cornwall, M. C. Visual Cycle and Its Metabolic Support in Gecko Photoreceptors. Vision Res. 47, 363-374 (2007).
- Chen, C., Blakeley, L. R., Koutalos, Y. Formation of All-Trans Retinol after Visual Pigment Bleaching in Mouse Photoreceptors. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 3589-3595 (2009).
