蛍光イメージングのための生活絶縁脊椎動物視細胞の調製
Summary
方法は、蛍光イメージングのための別の脊椎動物種から単生きた光受容細胞の調製のために説明されています。方法は、画像にそのようなNADHやビタミンAなどの内因性蛍光体の蛍光を使用し、又はCaに敏感な外因的に添加蛍光色素のことができる<sup> 2 +</sup>または他の要因。
Abstract
脊椎動物の網膜では、光伝達、電気信号に光の変換は、桿体と錐体視細胞1〜4で行われている。桿体は薄暗い光のビジョン、明るい光の円錐形のための責任があります。光伝達は光受容細胞、視色素、一次光検出器の高濃度が含まれている特殊なコンパートメントの外側の部分で行われます。視覚的な色素は、発色団、11で構成されて-タンパク質、オプシンに添付された、 シスレチナール。すべてのトランスへのシス -視覚色素によって吸収された光子は、11から発色団を異性化。この光異性化は、膜電位の変化で絶頂に達すると電気信号に光刺激の伝達をもたらす反応のカスケードを開始する視覚色素のコンフォメーション変化をもたらす。光刺激から細胞の回復は、光によって活性化中間体の不活性化、および膜電位の再確立を行います。のCa 2 +は、光情報伝達に関与する酵素のいくつかの活性を変調し、その濃度は、光刺激により低減されます。この方法では、Ca 2 +は背景光の光刺激とその適応からの細胞の回復において重要な役割を果たしている。
全トランス 5月7日にシス発色団-回復のプロセスの別の本質的な部分はその11の光異性化による光検出の際に破棄されている視覚色素の再生です。この再生は、アポタンパク質のオプシンを残し、光活性化顔料によって全トランスレチナールのリリースから始まります。リリースされたすべてのトランスレチナールは急速に全- トランスレチノールにNADPHを利用する反応で減少し、オプシンは新鮮な11で結合している-視覚的な色素を改革するために外側のセグメントに持ち込まれた網膜シス 。全- トランスレチノールは、専門のキャリアInterphotoreceptorレチノイド結合タンパク質（IRBP）で外側のセグメントで構成し、隣接する細胞へ搬出される。
単一視細胞の蛍光イメージングは、それらの生理学および細胞生物学を研究するために使用することができます。 のCa 2 +感受性蛍光色素8月12日だけでなく、内側のセグメントのCa 2の役割のCa 2 +ストアを明るみに詳細に外側のセグメントのCa 2 +の変化と応答の間の相互作用を調べるために使用することができます+ホメオスタシス13,14 。蛍光染料はまたのMg 2を測定するために使用することができます+濃度15、pHを、水性および膜のコンパートメント16のトレーサーとして。最後に、全- トランスレチノール（ビタミンA）の固有蛍光が単一の視細胞17から19で、その形成と除去の速度を監視するために使用することができます。
Protocol
Discussion
健康な単離された細胞が得られない場合、問題は、網膜の分離や健康状態、またはそのチョッピングのいずれかである。一般的に、眼と硝子体の前部を除去した後、網膜は容易に色素上皮をオフに持ち上げる。表示されない場合は、アイカップの周囲から始まるoffにはがしてみてください。それは分離することは依然として困難である場合は、おそらく可能性は、動物が時間の十分な期間の?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NEI助成金EY014850によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Dark room (100-150 ft2) | |||
| Red lights19 | Online stores | ||
| Infrared light sources and infrared image viewers | FJW Optical Systems, Inc. | ||
| Dissecting microscope19 | Outfitted with infrared viewers | ||
| Epifluorescence microscope enclosed in a light-tight cage19 | |||
| Dissecting tools (scissors, forceps, blade holder) | Roboz or Fine Science Tools | ||
| Sylgard elastomer | Essex (Charlotte, NC) | Sylgard 184 elastomer kit | |
| Poly-L-ornithine (0.01%) | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Poly-L-lysine (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | Dilute to 0.01% |
| Experimental chambers | Warner Instruments (Hamden, CT) | D3512P | |
| Petri dishes, plastic pipettes | Fisher Scientific |
Referências
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