형광 이미징을위한 절연 척추 Photoreceptor 세포를 생활 준비
Summary
방법은 형광 이미징에 대해 서로 다른 척추 동물에서 하나의 생활 photoreceptor 세포의 준비를 위해 설명되어 있습니다. 방법은 이미지와 같은 NADH이나 비타민 A와 같은 내생 fluorophores의 형광을 위해 사용하거나, CA에 민감한 exogenously 추가 형광 염료의 수<sup> 2 +</sup> 또는 기타 요인.
Abstract
척추 망막에서 phototransduction, 전기 신호에 빛의 변환,로드 앤드 원추 photoreceptor 세포 1-4에 의해 수행됩니다. 로드의 photoreceptors는 희미한 빛, 밝은 빛에서 원뿔의 비전에 대한 책임이 있습니다. Phototransduction는 photoreceptor 세포, 영상 안료, 기본 조명 감지기의 높은 농도를 포함하는 전문 구역의 바깥 부분에서 이루어진다. 망막 CIS, 단백질, 옵신에 첨부된 – 시각 색소는 발색단, 11로 구성되어 있습니다. 시각 색소에 흡수 광자는 11 발색단을 isomerizes – CIS를 모든 트랜스 있습니다. 이 photoisomerization는 막 잠재력에 변화 culminating, 그리고 전기 신호에 빛의 자극의 전달에 대한 데리고 반응의 폭포를 시작 시각 색소의 conformational 변화를 제공합니다. 빛의 자극에서 세포의 복구 빛으로 활성 중간체의 비활성화 및 멤브레인 잠재력의 회복을 포함한다. CA 2 +는 phototransduction에 관련된 효소의 몇 가지의 활동을 modulates, 그 농도가 빛의 자극에 따라 줄어 듭니다. 이러한 방법으로, CA 2 + 배경 빛으로 자극하고 적응에서 세포의 회복에 중요한 역할을합니다.
모든 트랜스 5-7로 CIS 발색단 – 복구 프로세스의 또 다른 필수적인 부분은 11 photoisomerization로 빛을 감지하는 동안 파괴되고있는 시각 색소의 재생이다. 이 중생은 APO – 단백질 옵신 뒤에두고, photoactivated 안료의 모든 트랜스 망막의 릴리스와 함께 시작됩니다. 출시된 모든 트랜스 망막이 빠르게 모든 트랜스 레티놀과 옵신에 NADPH를 이용한 반응 감소 것은 신선한 11 결합 – CIS 망막은 시각 색소를 개혁하기 위해 외부 세그먼트에 왔어요. 모든 트랜스 레티놀은 다음 전문 캐리어 Interphotoreceptor의 Retinoid 바인딩 단백질 (IRBP)에 의해 외부 세그먼트와 인접 세포 밖으로 전송됩니다.
단일 photoreceptor 세포의 형광 이미지들은 생리 및 세포 생물학을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. CA 2 +에 민감한 형광 염료 8-12뿐만 아니라 내부 세그먼트 칼슘 2의 역할 칼슘 2 + 점포 조명에 자세히 외부 세그먼트 칼슘 2 + 변화와 응답 사이의 상호 작용을 검사하는 데 사용할 수있는 + 항상성 13,14 . 형광 염료는 MG 2 측정에 사용할 수 있습니다 + 농도 15, 산도, 그리고 수성 및 멤브레인 구획 16 추적기로. 마지막으로, 모든 트랜스 레티놀 (비타민 A)의 본질적인 형광은 단일 photoreceptor 세포 17-19 년에 형성 및 제거의 속도론을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다.
Protocol
Discussion
건강 분리된 세포가 얻은 정보가 아닌 경우, 문제는 망막의 분리 또는 건강 또는 그 돼지와도 자리잡고 있습니다. 일반적으로, 눈 및 유리체의 전면을 제거 후, 망막이 쉽게 안료 상피를 리프트. 그렇지 않으면, 세안 컵의 주변부터 해제로 껍질보십시오. 아직 분리하기 어려운 경우에는 가능성이 가능성이 동물은 시간의 적절한 기간 동안 어두운 적응되지 않았음을, 또는 빨간 불빛이 너무 밝?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
네이 부여 EY014850 지원.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Dark room (100-150 ft2) | |||
| Red lights19 | Online stores | ||
| Infrared light sources and infrared image viewers | FJW Optical Systems, Inc. | ||
| Dissecting microscope19 | Outfitted with infrared viewers | ||
| Epifluorescence microscope enclosed in a light-tight cage19 | |||
| Dissecting tools (scissors, forceps, blade holder) | Roboz or Fine Science Tools | ||
| Sylgard elastomer | Essex (Charlotte, NC) | Sylgard 184 elastomer kit | |
| Poly-L-ornithine (0.01%) | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Poly-L-lysine (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | Dilute to 0.01% |
| Experimental chambers | Warner Instruments (Hamden, CT) | D3512P | |
| Petri dishes, plastic pipettes | Fisher Scientific |
Referências
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