Analisi mosaico della funzione del gene nello sviluppo postnatale cervello di topo mediante virus basati su ricombinazione Cre
Summary
Un<em> In vivo</emMetodo> per testare la funzione del gene nel cervello postnatale è descritto. AAVs ricombinanti che esprimono Cre e / o di una proteina fluorescente vengono iniettate nel cervello di topo neonatale. L'inattivazione del gene mosaico e rada etichettatura neuronali siano raggiunti, consentono una rapida analisi della funzione del gene nei processi critici per lo sviluppo del circuito neurale.
Abstract
Normali funzioni cerebrali si basa non solo sullo sviluppo embrionale in cui i principali percorsi neuronali sono stabiliti, ma anche sullo sviluppo postnatale, quando i circuiti neurali sono maturato e raffinato. Misregulation in questa fase può portare a disturbi neurologici e psichiatrici come l'autismo e la schizofrenia 1,2. Molti geni sono stati studiati nel cervello prenatale e ha trovato cruciali per molti processi di sviluppo 3-5. Tuttavia, la loro funzione nel cervello postnatale è in gran parte sconosciuto, anche perché la loro cancellazione in topi spesso conduce a mortalità durante lo sviluppo neonatale, e in parte perché la loro richiesta nel primo sviluppo ostacola l'analisi post-natale. Per superare questi ostacoli, floxed alleli di questi geni sono attualmente generati nei topi 6. Se combinato con alleli transgenici che esprimono Cre ricombinasi in tipi cellulari specifici, la cancellazione condizionale può essere raggiunto per studiare la funzione dei geni nel cervello postnatale. Tuttavia, questo metodo richiede alleli aggiuntivi e tempi supplementari (3-6 mesi) per generare i topi con genotipi del caso, limitando così l'espansione della analisi genetica di larga scala nel cervello di topo.
Qui mostriamo un approccio complementare che utilizza virale Cre-espresso per studiare questi alleli floxed rapidamente e sistematicamente nello sviluppo cerebrale postnatale. Iniettando ricombinante virus adeno-associati (rAAVs) 7,8 codifica Cre nel cervello neonatale, siamo in grado di eliminare il gene di interesse in diverse regioni del cervello. Controllando il titolo virale e coexpressing un marcatore fluorescente proteina, siamo in grado di raggiungere contemporaneamente l'inattivazione del gene mosaico e sparse etichettatura neuronale. Questo metodo evita l'esigenza di molti geni nello sviluppo iniziale, e ci permette di studiare la loro funzione autonoma delle cellule in molti processi critici nello sviluppo cerebrale postnatale, compresa la crescita assonale e dendritiche, ramificazione, e rivestimenti, come pure la formazione di sinapsi e raffinatezza. Questo metodo è stato utilizzato con successo nel nostro laboratorio proprio (risultati non pubblicati) e altri 8,9, e può essere esteso ad altri virus, come il lentivirus 9, così come l'espressione di shRNA o dominante proteine attive 10. Inoltre, combinando questa tecnica con elettrofisiologia così come recentemente sviluppato strumenti di imaging ottico 11, questo metodo fornisce una nuova strategia per studiare come i percorsi genetici influenzano lo sviluppo neurale del circuito e la funzione di topi e ratti.
Protocol
Discussion
Il metodo neonatale iniezione virale qui presentata fornisce un modo semplice e rapido per generare mosaici in vivo per lo studio dello sviluppo cerebrale postnatale. Il metodo si avvale di alleli floxed che sono attualmente disponibili e quelle che vengono effettuate tramite il gene targeting High Throughput progetto 6. Rispetto all'uso di espressione transgenica di Cre, questo metodo fornisce un modo rapido per testare la funzione del gene in vari tipi di cellule, come topi portatori degli alle…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è finanziato da una sovvenzione RO1 dal NIH (NINDS).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| rAAV8-Cre, -GFP, -DsRed, | Vector Biolabs | #7060, #7061, custom order | http://www.vectorbiolabs.com |
| Harvard Pump 11 Plus | Harvard Apparatus | #702208 | (No foot pedal port) |
| Retinal Pigment Epithelium Injection Kit | World Precision Instruments | RPE-KIT | Contains connective tubing, injection needles (36G), and needle holder |
| NanoFil Syringe, 100μl | World Precision Instruments | NANOFIL-100 | Includes reusable loading needle |
| D-PBS | Invitrogen | 14040-117 | |
| GFP antibody | Aves | GFP-1020 | |
| DsRed antibody | Clontech | 632496 | |
| Heating Block | VWR | 97042-610 | |
| ROSA26R mouse | Jackson Laboratory | 003309 |
Referências
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