Ovociti sono inclini a aneuploidia a causa di errori nella segregazione dei cromosomi durante la maturazione meiotica. Uova aneuploidi può causare infertilità, aborti o disturbi dello sviluppo, come la sindrome di Down. Qui, descriviamo i metodi per introdurre materiali di scelta in ovociti e metodi per lo studio maturazione meiotica e valutare ploidia.
Gli errori nella segregazione dei cromosomi portare a cellule aneuploidi. Nelle cellule somatiche, aneuploidia è associata con il cancro, ma in gameti, aneuploidia porta alla sterilità, aborti o disturbi dello sviluppo, come la sindrome di Down. Gameti aploidi forma attraverso la specie-specifici programmi di sviluppo che sono accoppiati a meiosi. La prima divisione meiotica (MI) è unica per meiosi perché cromatidi fratelli restano attaccati mentre cromosomi omologhi sono segregati. Per ragioni non pienamente compreso, questa divisione reductional è incline ad errori ed è più comunemente la fonte di aneuploidia di errori nella meiosi II (MII) o di errori in 1,2 meiosi maschile.
Nei mammiferi, l'arresto ovociti in profase di infarto miocardico con un grande vescicola germinale intatto (GV, nucleo) e solo riprendere la meiosi quando ricevono segnali ovulatorio. Una volta riprende la meiosi, MI ovociti completa e sottoposti ad una divisione cellulare asimmetrica, arrestando di nuovo in metafase di MII. Le uova non si completerà MII finché non vengono fecondati dagli spermatozoi. Ovociti possono anche subire la maturazione meiotica utilizzando stabilito de condizioni di coltura in vitro 3. Poiché la generazione di mutanti di topi transgenici e geni-bersaglio è costoso e può richiedere lunghi periodi di tempo, la manipolazione dei gameti femminili in vitro è una strategia più economico e risparmio di tempo.
Qui, descriviamo i metodi per isolare profase arrestato ovociti di topo e per la microiniezione. Qualsiasi materiale di scelta possono essere introdotti nel citoplasma dell'ovocita, ma perché meiotically-competente ovociti sono trascrizionalmente silente cRNA 4,5, e non il DNA, deve essere iniettato per gli studi di espressione ectopica. Per valutare la ploidia, descriviamo le nostre condizioni per la maturazione in vitro degli ovociti MII alle uova. Storicamente, cromosoma-tecniche di spandimento sono usati per contare il numero cromosoma 6. Questo metodo è tecnicamente impegnativa ed è limitata solo a identificare hyperploidies. Qui, descriviamo un metodo per determinare ipo-e hyperploidies utilizzando uova intatte 7-8. Questo metodo utilizza monastrol, un inibitore della chinesina-5, che crolla del fuso bipolare in un mandrino monopolare 9 cromosomi separando così in modo che cinetocori individuo può essere prontamente individuato e contati utilizzando un siero anti-CREST autoimmuni. Poiché questo metodo viene eseguito nelle uova intatte, i cromosomi non sono persi a causa di un errore dell'operatore.
Microiniezione degli ovociti è un metodo potente per studiare i meccanismi che regolano la maturazione meiotica 10,11, 12, 13. Questo metodo offre un modo economico per verificare ipotesi prima di effettuare un grande investimento per lo sviluppo di modelli di topi transgenici e mirati. Raccolta degli ovociti e tecniche di microiniezione richiedono più tempo per padroneggiare procedure tipiche di biologia cellulare. Ostacoli specifici con raccolta spesso includono il controllo della pipetta bocca, tirando la corretta dimensione pipetta di vetro per la raccolta e la rimozione delle cellule somatiche e aumentando la velocità di raccolta per ridurre al minimo il tempo in cui gli ovociti sono al di fuori del termostato. Si consiglia di praticare molte volte prima di fare esperimenti. Trasferimento di ovociti tra microgocce pur mantenendo lo stesso numero di cellule è un ottimo modo per familiarizzare con questo metodo.
La morte cellulare si verifica comunemente durante l'apprendimento microiniezione. Ciò potrebbe verificarsi per una serie di motivi, tra cui l'iniezione di troppo grande di un volume di materiale (cioè l'apertura ago per l'iniezione è troppo grande), colpendo il nucleo con l'ago di iniezione, il piercing sul lato opposto della ovocita o che il materiale iniettato è tossico per l'ovocita. Pratica con l'iniezione di buffer in ovociti fino a quando il tasso di sopravvivenza è almeno del 50% è la chiave per padroneggiare questa tecnica. Se gli ovociti non riescono a maturare, è probabile che il milrinone non è stato diluito abbastanza. Si consiglia il risciacquo degli ovociti attraverso molti grandi gocce di milrinone senza CZB prima maturazione.
La ploidia microiniezione seguente analisi è uno dei tanti test per valutare la maturazione meiotica. Altre analisi di routine che usiamo in laboratorio comprendere il controllo della cinetica con cui il progresso ovociti attraverso la meiosi, immunofluorescenza per analizzare la formazione del fuso e l'allineamento dei cromosomi e l'attivazione uovo o la fecondazione in vitro per valutare le conseguenze dello sviluppo della manipolazione dell'ovocita 14,15, 16, 17.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato condotto nel laboratorio di Richard M. Schultz 's. Gli autori desiderano inoltre ringraziare Michael Lampson per concettualizzare il centromero-conteggio saggio e l'accesso al suo microscopio confocale. Teresa Chiang e Francesca Duncan assistito ad ottimizzare il centromero-conteggio test. Paula Stein è supportato da HD022681 (a RMS) e Karen Schindler è supportato da HD055822.
Table of specific reagents:
Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
---|---|---|---|
Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | Resuspend in DMSO at 2.5mM |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Only use embryo-tested, sterile-filtered |
CREST autoserum | Immunovision | HCT-0100 | |
Sytox Green | Invitrogen | 57020 | |
Anti-human Alexa 594 | Invitrogen | A-11014 | |
Vectashield | Vector Laboratories | H-100 | |
Paraformaldehyde | Polysciences | 577773 | |
Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A3294 | |
PMSG | Calbiochem | 367222 | |
Monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | Resuspend in DMSO at 100mM |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X-100 |
Table of specific equipment:
Name of Equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
---|---|---|---|
Mouthpiece | Biodiseno | MP-001-Y | |
Watchglass | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | |
Syringe | B-D | 309623 | 1ml, 27G1/2 |
60 mm Petri Dish | Falcon | 351007 | |
Glass Pasteur pipets | Fisher scientific | 13-678-200 | |
Side warmer | Fisher scientific | Any standard model | |
Dissection microscope | Any standard model | ||
Chamber Slide | Nunc | 177372 | |
Capillary Tubing | Drummond | 1-000-0500 | microcaps |
Pipette Puller | Flaming-Brown micropipette puller | Model P-97 | |
Inverted microscope | Nikon | Any standard model | |
Micromanipulators | Eppendorf | Any standard model | |
Picoinjector | Harvard Apparatus | Model PLI-100 | Any standard model |
CO2 tanks | For incubator | ||
N2 tank | For table and injector | ||
Anti-vibration table | Technical Manufacturing | Any standard model | |
Incubator | Any standard model | ||
Holding pipettes | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
Confocal microscope | Leica | Any standard model | |
Dissection tools | Fine science tools | Any standard model | |
Humidified chamber | We use tupperware | ||
Lid of 96 well plate | Nunc | 263339 | |
Microscope slides | Fisher scientific | 12-544-3 | |
Coverslips | Thomas scientific | 6663-F10 | Thickness will vary for particular microscopes |
Center well organ culture dish | Fisher scientific | 353037 | 60 X 15mm |