Eicellen zijn gevoelig voor te wijten aan fouten in chromosoom segregatie aneuploïdie tijdens de meiotische rijping. Aneuploïde eieren kan leiden tot onvruchtbaarheid, miskramen of ontwikkelingsstoornissen, zoals het syndroom van Down. Hier beschrijven we methoden om materialen van keuze te introduceren in eicellen en methoden om meiotische rijping onderzoeken en te beoordelen ploïdie.
Fouten in chromosoom segregatie leiden tot aneuploïde cellen. In somatische cellen, is geassocieerd met aneuploidie kanker, maar in gameten, aneuploïdie leidt tot onvruchtbaarheid, miskramen of ontwikkelingsstoornissen, zoals het syndroom van Down. Haploïde gameten vormen door middel van soort-specifieke ontwikkelingsprogramma's die gekoppeld zijn aan meiose. De eerste meiotische deling (MI) is uniek voor meiose omdat zusterchromatiden verbonden blijven terwijl de homologe chromosomen worden gescheiden. Om redenen die niet volledig begrepen, dit reductional divisie is gevoelig voor fouten en is meer algemeen de bron is van aneuploïdie dan fouten in de meiose II (MII) en dan fouten in de mannelijke meiose 1,2.
Bij zoogdieren, eicellen arrestatie op profase van MI met een grote, intact germinal vesicle (GV, nucleus) en pas te hervatten de meiose wanneer ze ovulatoire cues. Eenmaal meiose hervat, eicellen volledige MI en onderworpen aan een asymmetrische celdeling, gearresteerd opnieuw bij metafase van de MII. Eieren niet compleet MII totdat ze worden bevrucht door sperma. Eicellen kunnen ook ondergaan meiose rijping met behulp van gevestigde in vitro kweekomstandigheden 3. Omdat de generatie van transgene en gen-gerichte muizenmutanten is kostbaar en kan lange tijd, manipulatie van vrouwelijke gameten in vitro is een meer economische en tijdbesparende strategie.
Hier beschrijven we methoden om profase gearresteerd eicellen te isoleren van muizen en voor micro-injectie. Al het materiaal van keuze kan worden geïntroduceerd in de eicel, maar omdat meiotisch-competente eicellen zijn transcriptioneel stil 4,5 cRNA, en niet DNA, moeten worden geïnjecteerd voor ectopische expressie studies. Voor de beoordeling van ploïdie, beschrijven we onze voorwaarden voor in vitro rijping van eicellen te MII eieren. Historisch gezien zijn chromosoom-het verspreiden van technieken die worden gebruikt voor het tellen van chromosoom nummer 6. Deze methode is technisch uitdagend en is beperkt tot slechts het identificeren van hyperploidies. Hier beschrijven we een methode om hypo-en hyperploidies met behulp van intacte eieren 7-8 te bepalen. Deze methode maakt gebruik van monastrol, een kinesine-5-remmer, dat de bipolaire spindel stort in een monopolaire spindel 9 dus gescheiden chromosomen zodat individuele kinetochoren gemakkelijk kan worden gedetecteerd en geteld met behulp van een anti-CREST auto-serum. Omdat deze methode is uitgevoerd in intacte eieren, zijn chromosomen niet verloren als gevolg van menselijke fouten.
Micro-injectie van eicellen is een krachtige methode om mechanismen die meiotische rijping 10,11, 12, 13 reguleren te bestuderen. Deze methode biedt een voordelige manier om te testen voordat hypothesen het maken van een grote investering in de ontwikkeling van transgene en gerichte muismodellen. Eicel verzamelen en micro-injectie technieken vereisen meer tijd onder de knie dan de typische celbiologie procedures. Specifieke belemmeringen met collectie bevatten vaak het beheersen van de mond pipet, het trekken van de juiste maat glazen pipet voor het verzamelen en het strippen van de somatische cellen en de toenemende collectie snelheid aan de tijd waarin eicellen worden buiten de couveuse te minimaliseren. We raden aan het oefenen vaak voorafgaand aan het doen experimenten. De overdracht van eicellen tussen microdruppels met behoud van hetzelfde aantal cellen is een geweldige manier om vertrouwd raken met deze methode.
Celdood komt vaak voor tijdens het leren van micro-injectie. Dit kan gebeuren om een aantal redenen, waaronder injectie van te grote van een volume van het materiaal (dat wil zeggen de injectie naald opening is te groot), het raken van de kern met de injectienaald, piercing de andere kant van de eicel geïnjecteerd of dat het materiaal is giftig voor de eicel. Oefenen met injecteren in eicellen buffer totdat uw overlevingskans ten minste 50% is de sleutel tot het beheersen van deze techniek. Als eicellen niet rijp is het waarschijnlijk dat de milrinon niet genoeg was verdund. Wij raden het spoelen van de eicellen door middel van veel grote druppels milrinon-vrij CZB voor rijping.
De ploïdie analyse na micro-injectie is een van de vele testen om te beoordelen meiotische rijping. Andere routine-analyses die we gebruiken in het laboratorium onder andere het toezicht op de kinetiek van de eicellen vooruitgang door meiose, immunofluorescentie op spindel vorming en chromosoom afstemming en ei activering analyseren of in vitro fertilisatie om de ontwikkeling gevolgen van de eicel manipulatie 14,15, 16 te beoordelen, 17.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd uitgevoerd in Richard M. Schultz 's laboratorium. De auteurs wil ook Michael Lampson erkennen voor het conceptualiseren van de centromeer-test en het tellen van toegang tot zijn confocale microscoop. Teresa Chiang en Francesca Duncan assisteerde bij het optimaliseren van de centromeer-tellen assay. Paula Stein wordt ondersteund door HD022681 (RMS) en Karen Schindler wordt ondersteund door HD055822.
Table of specific reagents:
Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
---|---|---|---|
Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | Resuspend in DMSO at 2.5mM |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Only use embryo-tested, sterile-filtered |
CREST autoserum | Immunovision | HCT-0100 | |
Sytox Green | Invitrogen | 57020 | |
Anti-human Alexa 594 | Invitrogen | A-11014 | |
Vectashield | Vector Laboratories | H-100 | |
Paraformaldehyde | Polysciences | 577773 | |
Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A3294 | |
PMSG | Calbiochem | 367222 | |
Monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | Resuspend in DMSO at 100mM |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X-100 |
Table of specific equipment:
Name of Equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
---|---|---|---|
Mouthpiece | Biodiseno | MP-001-Y | |
Watchglass | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | |
Syringe | B-D | 309623 | 1ml, 27G1/2 |
60 mm Petri Dish | Falcon | 351007 | |
Glass Pasteur pipets | Fisher scientific | 13-678-200 | |
Side warmer | Fisher scientific | Any standard model | |
Dissection microscope | Any standard model | ||
Chamber Slide | Nunc | 177372 | |
Capillary Tubing | Drummond | 1-000-0500 | microcaps |
Pipette Puller | Flaming-Brown micropipette puller | Model P-97 | |
Inverted microscope | Nikon | Any standard model | |
Micromanipulators | Eppendorf | Any standard model | |
Picoinjector | Harvard Apparatus | Model PLI-100 | Any standard model |
CO2 tanks | For incubator | ||
N2 tank | For table and injector | ||
Anti-vibration table | Technical Manufacturing | Any standard model | |
Incubator | Any standard model | ||
Holding pipettes | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
Confocal microscope | Leica | Any standard model | |
Dissection tools | Fine science tools | Any standard model | |
Humidified chamber | We use tupperware | ||
Lid of 96 well plate | Nunc | 263339 | |
Microscope slides | Fisher scientific | 12-544-3 | |
Coverslips | Thomas scientific | 6663-F10 | Thickness will vary for particular microscopes |
Center well organ culture dish | Fisher scientific | 353037 | 60 X 15mm |