Мутагенеза и анализа генетических мутаций в GC-богатых KISS1 рецепторов Последовательность Выявленные у людей с репродуктивным расстройствам
Summary
Мутации в kisspeptin рецепторов (KISS1R) связаны с репродуктивные расстройства у больных. Здесь мы опишем, как ввести мутации интереса к GC-богатые последовательности KISS1R, а также использование конструкций KISS1R охарактеризовать путь деградации рецептора иммунопреципитации и иммуноблоттинга
Abstract
Kisspeptin рецепторов (KISS1R) является G-белком рецептор признан курок полового созревания и регулятором репродуктивной компетенции в зрелом возрасте 1,2,3. Инактивирующих мутаций в KISS1R идентифицированы у пациентов были связаны с iodiopathic гипогонадотропный гипогонадизм (IHH) 1,2 и преждевременным половым созреванием 4. Функциональные исследования этих мутантов имеют решающее значение для понимания механизмов, лежащих в регуляции размножения этим рецептором, а также теми, кто определяет болезнь результаты, которые получаются в результате ненормального сигнализации KISS1R и функции. Тем не менее, высоко GC-богатые последовательности гена KISS1R делает его довольно трудно представить мутации или усиливать ген, кодирующий этот рецептор с помощью ПЦР.
Здесь мы опишем метод введения мутаций интерес в этой весьма GC-богатые последовательности, которые были успешно использованы для создания более десятка KISS1R мутантов в нашей лаборатории. Мы оптимизировали ПЦР условия для облегчения усиления спектр KISS1R мутантов, которые включают замены, делеции или вставки в последовательности KISS1R. Помимо решения ПЦР усилитель, а также небольшой процент ДМСО были особенно полезны для улучшения усиления. Такая оптимизированная процедура может быть полезным для других GC-богатых шаблонов, а также.
Выражение вектора, кодирующего KISS1R это использовалось для характеристики сигнализации и функции этого рецептора для того, чтобы понять, как мутации могут менять KISS1R функции и привести к репродуктивным связанных фенотипов. Соответственно, возможности применения KISS1R мутантов порожденных сайт-направленного мутагенеза можно проиллюстрировать многими исследованиями 1,4,5,6,7,8. Как, например, получить-функции мутации в KISS1R (Arg386Pro), что связано с преждевременным половым созреванием, как было показано, чтобы продлить реагирования рецептора лиганда стимуляции 4, а также изменять скорость деградации KISS1R 9 . Интересно, что наши исследования показывают, что KISS1R разлагается под протеасомы, в отличие от классического лизосомальных деградации описаны для большинства G-белком рецепторы 9. В примере, приведенном здесь, деградация KISS1R исследуется в человеческих эмбриональных клеток почки (HEK-293) временно выражения Myc с метками KISS1R (MycKISS1R) и обрабатывают протеасом или лизосомы ингибиторов. Сотовые лизатов являются иммунопреципитации использованием агарозы-сопряженных анти-Myc антител с последующим анализом пятно западной. Обнаружение и количественное определение MycKISS1R на пятна осуществляется с помощью LI-COR Odyssey Инфракрасная система. Такой подход может быть полезным при изучении деградации других белков интерес.
Protocol
Discussion
Сайт-направленный мутагенез был использован для исследования функции белка, вводя изменения в нуклеотидной последовательности, кодирующей целевых генов на протяжении более трех десятилетий. Оригинальная методика была описана в 1978 году англо-канадского химик, лауреат Нобелевской пр?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа частично финансировалась Репродуктивное отделения Национального института детского здоровья и человеческого развития (NICHD – R21 HD059015) и Чарльз Х. Худа Фонд молодых следователь ребенка исследованиям в области здравоохранения премию (Бостон, Массачусетс).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| 10x PCRx Enhancer Solution | Invitrogen | 52391 |
| PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase Alternative Detergent | Stratagene | 600385 |
| Dpn-I | New England Biolabs | R0176 |
| XL10-Gold Ultracompetent E. coli cells | Stratagene | 200314 |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 |
| Geneporter Transfection Reagent | Genlantis | T201007 |
| Leupeptin | Calbiochem | 108975 |
| MG132 | Calbiochem | 47491 |
| 10xPBS | Ambion | AM9625 |
| Protease inhibitor cocktail and PMSF | Santa Cruz Biotechnology | Sc-24948 |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 |
| anti-Myc tag (clone 4A6) agarose conjugate | Millipore | 16-219 |
| 2x loading buffer | BioRad | 161-0737 |
| Criterion Tris-HCl precast gel, 4-15% gradient | BioRad | 345-0028 |
| Immobilon-FL PVDF membrane | Millipore | IPFL00010 |
| Odyssey Blocking Buffer | LI-COR Biosciences | 927-40000 |
| 10xTBS | BioRad | 170-6435 |
| Rabbit anti-myc antibody | Cell signaling | 2272 |
| Goat anti-rabbit IRDye 800CW | LI-COR Biosciences | 926-32211 |
| Odyssey Imaging Infrared System | LI-COR Biosciences | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) | Thermo Scientific | 78430 |
Referências
- Seminara, S. B., Messager, S., Chatzidaki, E. E. The GPR54 Gene as a Regulator of Puberty. N Engl J Med. 349, 1614-1627 (2003).
- de Roux, N., Genin, E., Carel, J. C. Hypogonadotropic Hypogonadism Due to Loss of Function of the KiSS1-Derived Peptide Receptor GPR54. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 10972-10976 (2003).
- Messager, S., Chatzidaki, E. E., Ma, D. Kisspeptin Directly Stimulates Gonadotropin-Releasing Hormone Release via G Protein-Coupled Receptor 54. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1761-1766 (2005).
- Teles, M. G., Bianco, S. D., Brito, V. N. A GPR54-Activating Mutation in a Patient with Central Precocious Puberty. N Engl J Med. 358, 709-715 (2008).
- Tenenbaum-Rakover, Y., Commenges-Ducos, M., Iovane, A. Neuroendocrine Phenotype Analysis in Five Patients with Isolated Hypogonadotropic Hypogonadism due to a L102P Inactivating Mutation of GPR54. J Clin Endocrinol Metab. 92, 1137-1144 (2007).
- Semple, R. K., Achermann, J. C., Ellery, J. Two Novel Missense Mutations in G Protein-Coupled Receptor 54 in a Patient with Hypogonadotropic Hypogonadism. J Clin Endocrinol Metab. 90, 1849-1855 (2005).
- Wacker, J. L., Feller, D. B., Tang, X. B. Disease-Causing Mutation in GPR54 Reveals the Importance of the Second Intracellular Loop for Class A G-Protein-Coupled Receptor Function. J Biol Chem. 283, 31068-31078 (2008).
- Szereszewski, J. M., Pampillo, M., Ahow, M. R. GPR54 regulates ERK1/2 activity and hypothalamic gene expression in a Galpha(q/11) and beta-arrestin-dependent manner. PLoS One. 5, e12964-e12964 (2010).
- Bianco, S. D. C., Vandepas, L., Correa-Medina, M., Gereben, B., Mukherjee, A., Kuohung, W., Carroll, R., Teles, M. G., Latronico, A. C., Kaiser, U. B. KISS1R Intracellular Trafficking and Degradation: Effect of the Arg386Pro Disease-Associated Mutation. Endocrinology. , (2011).
- Hutchison, C. A., Phillips, S., Edgell, M. H. Mutagenesis at a Specific Position in a DNA Sequence. J Biol Chem. 253, 6551-6560 (1978).
- Mullis, K. B. The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction. Sci Am. 262, 56-61 (1990).
- Henke, W., Herdel, K., Jung, K., Schnorr, D., Loening, S. A. Betaine improves the PCR amplification of GC-rich DNA sequences. Nucleic Acids Res. 25, 3957-3958 (1997).
- Sahdev, S., Saini, S., Tiwari, P., Saxena, S., Singh Saini, K. Amplification of GC-rich genes by following a combination strategy of primer design, enhancers and modified PCR cycle conditions. Mol Cell Probes. 21, 303-307 (2007).
- Kong, K. C., Poyner, D. R., Wheatly, M. Chapter 10. MSTA. in G Protein-Coupled Receptors: Essential Methods. , 197-204 (2010).
- Hall, R. A., George, S. R., O’Dowd, B. F. Chapter 9. G protein-Coupled Receptor-Protein Interactions. , 170-171 (2005).
- Chaturvedi, K., Bandari, P., Chinen, N., Howells, R. D. Proteasome Involvement in Agonist-Induced Down-Regulation of Mu and Delta Opioid Receptors. J Biol Chem. 276, 12345-12355 (2001).
- Shenoy, S. K., McDonald, P. H., Kohout, T. A., Lefkowitz, R. J. Regulation of Receptor Fate by Ubiquitination of Activated Beta 2-Adrenergic Receptor and Beta-Arrestin. Science. 294, 1307-1313 (2001).
