Мы представляем лентивирусов методика генетических манипуляций и визуализации одной обонятельной сенсорных аксонов нейронов и его терминал разветвление<em> В естественных условиях</em>.
Abstract
Развитие точных обонятельных схема опирается на точные проекции обонятельной сенсорных нейронов (ОСН), аксоны их синаптических целей в обонятельной луковице (OB). Молекулярные механизмы OSN аксон роста и ориентации не до конца понятны. Манипулирование экспрессии генов и последующей визуализации одного аксонов OSN и их терминал беседка морфологии до сих пор подвергают сомнению. Для изучения функций генов на одном уровне ячейки в указанный период времени, мы разработали лентивирусов техника выполнения манипулировать экспрессии генов в OSNs в естественных условиях. Лентивирусов частицы поступают в OSNs путем микроинъекции в обонятельный эпителий (OE). Выражение кассеты затем постоянно интегрироваться в геном трансдуцированных OSNs. Зеленый флуоресцентный белок определяет выражение инфицированных OSNs и очертания всей своей морфологии, в том числе аксон терминал беседке. Из-за короткого времени оборота между микроинъекции и репортер обнаружения, исследования функции генов может быть сосредоточено в пределах очень узкого периода развития. С помощью этого метода, мы обнаружили GFP выражение в всего лишь три дня и в течение трех месяцев после инъекции. Мы достигли как по-выражения и shRNA опосредованной нокдауна от лентивирусов микроинъекции. Этот метод обеспечивает подробные морфология OSN клеточных тел и аксонов на одном уровне клетка в живом организме, и таким образом позволяет характеристику кандидата функции генов обонятельных во время развития.
Protocol
1. Подготовка Эта процедура биобезопасности 2-го уровня, поэтому все следующие препараты производятся в биологически опасных капотом, где микроинъекции процедура будет выполнена. Подготовка и подогрева 37 ° С водяной кровати: Заполнить пластиковый мешок хране…
Discussion
Микроинъекции лентивирус приводит к постоянной передаче генные конструкции в геномной ДНК OSN. Такой подход позволяет нам выполнять краткосрочные или долгосрочные манипуляции генов-кандидатов через гиперэкспрессия или опосредованной shRNA нокдауна. Кроме того, мы можем флуоресцентно э…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование проводится при поддержке НИЗ DC052256 и DC006015 и NSF 0324769 на QG и T32-DC008072 к BS.
Materials
Microinjection: Newborn mice were microinjected using a 5μL Hamilton syringe (Hamilton #7647-01) fitted with a 33 gauge needle (Hamilton #7762-06).
Immunocytochemistry Reagents: Primary antibodies: rabbit polyclonal antibody GFP (Molecular Probes# A-6455), chicken polyclonal antibody against OMP (custom) (Chen et al., 2005), guinea pig polyclonal antibody against VGlut2 (Millipore# AB2251). Secondary antibodies: Cy2-conjugated donkey anti-rabbit (Jackson Immunolab# 711-225-152), Cy3-conjugated donkey-anti-chicken (Jackson Immunolab# 703-165-155) and Cy5-conjugated goat anti-guinea pig (Jackson Immunolab# 106-175-008). Sections were mounted on glass slides with Fluoromount G (Southern Biotech# 0010-01) with 50ng/mL DAPI chromatin stain solution.
Confocal Imaging: Z-stack images were taken using an Olympus Flouview FV1000 confocal microscope and images collected and processed into 3D projections using Olympus FV10-ASW 2.01 confocal acquisition and analysis software.