Lentivirus-gemedieerde genetische manipulatie en visualisatie van olfactorische sensorische neuronen In vivo</em

Summary

We presenteren een lentivirale techniek voor genetische manipulatie en visualisatie van een olfactorische sensorische neuron axon en de terminal arborization<em> In vivo</em>.

Abstract

De ontwikkeling van een nauwkeurige olfactorische circuit is gebaseerd op nauwkeurige projectie van olfactorische sensorische neuron (OSN) axonen naar hun synaptische doelen in de bulbus olfactorius (OB). De moleculaire mechanismen van OSN axongroei en targeting worden niet goed begrepen. Het manipuleren van genexpressie en de daaropvolgende visualiseren van enkele OSN axonen en hun terminal prieel morfologie zijn tot nu toe uitdagend. Om te studeren gen functie op de enkele cel niveau binnen een bepaalde termijn, ontwikkelden we een lentivirale gebaseerde techniek om genexpressie te manipuleren in OSNs in vivo. Lentivirale deeltjes worden geleverd aan OSNs door micro-injectie in het reukepitheel (OE). Expressiecassettes worden dan permanent geïntegreerd in het genoom van getransduceerde OSNs. Groen fluorescerend eiwit expressie herkent besmette OSNs en schetst hun hele morfologie, inclusief de axon terminal prieel. Vanwege de korte doorlooptijd tussen de micro-injectie en verslaggever detectie, kunnen genen functie studies worden geconcentreerd binnen een zeer nauwe periode van ontwikkeling. Met deze methode hebben we ontdekt GFP expressie binnen slechts drie dagen en zo lang als drie maanden na de injectie. We hebben bereikt zowel over-expressie en shRNA gemedieerde knock-down door lentiviraal micro-injectie. Deze methode biedt gedetailleerde morfologie van de OSN cellichamen en axonen op de single cell niveau in vivo, en dus maakt karakterisering van kandidaat-gen olfactorische functie tijdens ontwikkeling.

Protocol

1. Voorbereiding Deze procedure is bioveiligheidsniveau 2, dus alle de volgende voorbereidingen worden gemaakt in een biohazard kap, waar de micro-injectie procedure wordt uitgevoerd. Voor te bereiden en verwarm een ​​37 ° C waterbed: Vul een plastic zak met water – afdichting en ingesteld op een lege verwarmingsblok incubator. Dit zal toelaten muizen om na de injectie te herstellen. Vul een biologisch afval container met 10% bleekwater om een ​​geschik…

Discussion

Micro-injectie van lentivirus resulteert in een permanente overdracht van gen-constructen in OSN genomisch DNA. Deze aanpak stelt ons in staat om te presteren op korte termijn of lange termijn manipulaties van kandidaat-genen via overexpressie of shRNA gemedieerde knock-down. Daarnaast kunnen we fluorescent label single OSNs in een bestaande transgene muis lijn naar co-lokalisatie van geurende receptor populaties te observeren. Micro-injectie is nodig voor lentiviraal transductie van OSNs. We hebben geprobeerd spoelen l…

Materials

Microinjection: Newborn mice were microinjected using a 5μL Hamilton syringe (Hamilton #7647-01) fitted with a 33 gauge needle (Hamilton #7762-06).

Immunocytochemistry Reagents: Primary antibodies: rabbit polyclonal antibody GFP (Molecular Probes# A-6455), chicken polyclonal antibody against OMP (custom) (Chen et al., 2005), guinea pig polyclonal antibody against VGlut2 (Millipore# AB2251). Secondary antibodies: Cy2-conjugated donkey anti-rabbit (Jackson Immunolab# 711-225-152), Cy3-conjugated donkey-anti-chicken (Jackson Immunolab# 703-165-155) and Cy5-conjugated goat anti-guinea pig (Jackson Immunolab# 106-175-008). Sections were mounted on glass slides with Fluoromount G (Southern Biotech# 0010-01) with 50ng/mL DAPI chromatin stain solution.

Confocal Imaging: Z-stack images were taken using an Olympus Flouview FV1000 confocal microscope and images collected and processed into 3D projections using Olympus FV10-ASW 2.01 confocal acquisition and analysis software.