Подготовка взрослых Drosophila Глаза для тонких Секционирование и микроскопический анализ

Summary

Стандартный подход к подготовке взрослых<em> Drosophila</em> Глаза для полу-тонкие и легкие срезов микроскопического анализа представлена ​​здесь. Протокол может быть использован для валового морфологического анализа глазом дефектов, или с указанной поправки могут быть использованы для определения генетических требования генов в специфических типов клеток в глазу (например, клонального анализа фоторецепторов) или электронно-микроскопического анализа.

Abstract

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a plethora of mutant strains and technical tricks have been developed to allow sophisticated questions to be asked and answered in a reasonable amount of time. Fundamental insight into the interplay of components of all known major signaling pathways has been obtained in forward and reverse genetic Drosophila studies. The fly eye has proven to be exceptionally well suited for mutational analysis, since, under laboratory conditions, flies can survive without functional eyes. Furthermore, the surface of the insect eye is composed of some 800 individual unit eyes (facets or ommatidia) that form a regular, smooth surface when looked at under a dissecting microscope. Thus, it is easy to see whether a mutation might affect eye development or growth by externally looking for the loss of the smooth surface (‘rough eye’ phenotype; Fig. 1) or overall eye size, respectively (for examples of screens based on external eye morphology see e.g.¹). Subsequent detailed analyses of eye phenotypes require fixation, plastic embedding and thin-sectioning of adult eyes.

The Drosophila eye develops from the so-called eye imaginal disc, a bag of epithelial cells that proliferate and differentiate during larval and pupal stages (for review see e.g. ²). Each ommatidium consists of 20 cells, including eight photoreceptors (PR or R-cells; Fig. 2), four lens-secreting cone cells, pigment cells (‘hexagon’ around R-cell cluster) and a bristle. The photoreceptors of each ommatidium, most easily identified by their light sensitive organelles, the rhabdomeres, are organized in a trapezoid made up of the six “outer” (R1-6) and two “inner” photoreceptors (R7/8; R8 [Fig. 2] is underneath R7 and thus only seen in sections from deeper areas of the eye). The trapezoid of each facet is precisely aligned with those of its neighbors and the overall anteroposterior and dorsoventral axes of the eye (Fig. 3A). In particular, the ommatidia of the dorsal and ventral (black and red arrows, respectively) halves of the eye are mirror images of each other and correspond to two chiral forms established during planar cell polarity signaling (for review see e.g. ³).

The method to generate semi-thin eye sections (such as those presented in Fig. 3) described here is slightly modified from the one originally described by Tomlinson and Ready⁴. It allows the morphological analysis of all cells except for the transparent cone cells. In addition, the pigment of R-cells (blue arrowheads in Fig. 2 and 3) can be used as a cell-autonomous marker for the genotype of a R-cell, thus genetic requirements of genes in a subset of R-cells can readily be determined^5,6.

Protocol

1. Fly голову рассечение Убедитесь, что все материалы под рукой (в том числе покрытые желатином слайды). Подготовка глутаральдегида и осмия фиксаторов (см. ниже). Пер генотип для встраивания, аликвоту 200 мкл решение исправить глутаральдегида в 1,5 мл труб на льду. Обезболить летает на CO 2 площадки (обычно мы проанализируем семь лететь головы вставлять шести в генотипе в случае, одна голова разрушен во время процедуры). Удержание и слегка нажмите грудной клетки летать, спинной стороной вверх, с помощью пинцета и использование острого скальпеля, чтобы отрезать голову. Стабилизировать летать голову, касаясь шеи с пинцетом и аккуратно отрезать небольшую часть одного глаза. Это улучшает проникновение фиксатором (если вы собираетесь использовать разделы око за клонального анализа, вырезать глаз с отсутствием или меньше клоны). Старайтесь не прикасаться и повреждения нетронутыми глаза, который позже будет секционного. Сенсорный головы с помощью пинцета или скальпеля на поверхности отрезать глаз и передачу головой в глутаральдегида / фосфат фиксатором на льду (руководители часто плавают на верхней части фиксатора) расчлененный головы не должны храниться в глутаральдегида исправить дольше чем за 15 минут до того осмия. Повторите шаги с 1.2-1.5 с других мух одного и того же генотипа. 2. Фиксация и вложение (используйте перчатки для всех шагов!) Спиновые flyheads в центрифуге Эппендорф течение 1 минуты при 10000 оборотах в минуту. Продолжить, даже если главы не тонут. Добавить 200 мкл OsO 4 решения и исправить, по крайней мере 30 минут до 1 часа на льду. С помощью пипетки Пастера, удалить глутаральдегида / осмий решение (не забудьте использовать надлежащие процедуры утилизации отходов!) И заменить 200 мкл решение осмия. Инкубировать на льду в течение 1-6 часов. Всегда проверяйте главы полностью покрыты жидкостью и никогда не удалить все решения в качестве руководителей или в глаза может рухнуть! С помощью пипетки Пастера, отказаться от фиксатора, добавить 0,5-1мл 30% этилового спирта и выдержать в течение не менее 5 минут на льду (не забудьте использовать надлежащие процедуры утилизации отходов с этанолом в настоящее время содержит Осмий!). Повторите предыдущий шаг с 50%, 70%, (80%), 90% и в два раза 100% этанола. Включая 80% этанола шаг, если использование глаз для электронно-микроскопического анализа. После 70% мыть шаг, образцы могут быть удалены из льда. Замените этанола с равным объемом окиси пропилена (летучие, продолжают работать в капюшоне). Инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре. Повторите мыть окиси пропилена. Работа в партии, если обработка многих генотипов параллельно, чтобы избежать коллапса в глаза из-за испарения окиси пропилена. Удалите большую часть окиси пропилена и использование пластиковой пипетки передачи, добавить около 500 мкл в 1:01 смолы: раствор оксида пропилена. Равновесие на ночь при комнатной температуре. 3. Вложения и расположение в формах Убедитесь, что все формы помечены, чтобы следить за своими различных генотипов, а затем заполнить формы с 100% смолы. Не перегружайте (нет "высокие горы" по поверхности формы при взгляде прямо по поверхности формы). Используйте жесткие смолы для анализа EM. Использование передачи пипетки удалить 50% смолы от головы, заменить 100% смолы, и выдержать в течение 3-4 часов при комнатной температуре. Как головки проникли со смолой, они опускаются на дно пробирки. Используя зубочистку, которая была хитом на твердую поверхность, один раз, чтобы создать маленький крючок, передача одной голове в то время в форму. Место алюминиевой фольги на рабочую область вашего рассекает рамки для защиты от смолы разливов. Использование рассекает иглу и, глядя если ваш объем, вихрем голову слегка в смолу и осторожно переместите ее на дно формы близки к заостренным концом. Тщательно выровняйте поверхность без изменений (!) Глаза (или вашего будущего секционирования плоскости, если вы хотите иметь сечения) горлышком вниз с передней стенки формы, убедившись, что держать тангенциальной поверхности глаза примерно половина головы диаметром от формы стены. В редких случаях, глаз падает, которые могут рассматриваться как пустое пространство между поверхностью глаза и голова кутикулы. Если у вас есть рухнула глаз, заменить его на 7-й запасной глаз. Повторить со всеми руководителями. После этого со всеми выравнивания, еще раз проверьте все глаза, чтобы убедиться, что они не двигались, когда вы удалили иглу из смолы. Если у вас возникли проблемы с глазами движущихся при удалении рассекает иглы, положение глаз, как желаемое, быстро убрать иглу немного в сторону от головы, а затем медленно извлеките иглу полностью. Выпекать формы в течение ночи при 70 ° C. 4. Обрезка и секционирования Удалить закаленной кварталах от формы, сгибая формы, кeeping отслеживать, какой блок соответствует генотип которых (например, хранить в небольших флаконах сцинтилляционных). Для отделки используется патрон подходит для вашей микротома, который установлен лицевой стороной вверх на блок из оргстекла или алюминия. Горы блок для отсечения, глаз, в патроне. В области с помощью вскрытия с тефлоновым покрытием бритвы велел, тщательно отрезать только верхний слой вашего блока. Это оставит прозрачную поверхность, через которые вы должны увидеть глаза и тем самым могут предсказывать будущее плоскости срезов. Избегайте резки ваши пальцы! Отрезанные остатки пластмассы по обе стороны головы и на передней (т.е. то, что когда-то в верхней части формы при выравнивании глаз), пока большая часть пластиковых всему голова отрезана. Лучше всего медленно приближаются голову отрезать несколько тонких слоев пластика. Используя чистую лезвие бритвы, осторожно удалите тонкие слои из верхней части глаза в точной плоскости вы хотите разделу (как правило, по касательной к глазу, под небольшим углом к ​​исходной поверхности плесени). Продолжайте, пока вы не начнете срезать внешнюю поверхность глаза. Убедитесь, что вы используете чистых районах лезвие, чтобы получить блестящие, прозрачные поверхности, что делает выравнивание в микротома легче. Чтобы сэкономить на бритвенные лезвия, используют старые лезвия для сырой обрезки по бокам блока и использовать свежим лезвием для тонкой отделки (первое сокращение и 4.6). В конце концов у вас будет три пирамиды с небольшим наклоном, отключение топ, который соответствует вашей будущей плоскости сечения. Горы блока в микротоме. Фактические секционирования будет варьироваться в зависимости от типа микротома и не будут подробно описаны здесь. Мы используем Sorvall MT5000 с бриллиантом историка качества нож, чтобы сократить 0,5 до 1 мкм разделов. Для легких микроскопический анализ, небольшие изменения в разделе толщиной не имеют значения. Если секционирования клонов отмечен Белый + трансгенов, раздел 1 мкм разделов, чтобы обеспечить достаточно гранулы пигмента, прилегающих к рабдомерами в каждой секции (рис. 2). Разделы будет плавать на воде. Поднимите первых 20-30 секций с уплощенной конце деревянной Q-Tip из-под поверхности воды в вращательное движение и передача их в каплю воды на желатин покрытием предметное стекло (хранится на нагревательного элемента составляет около 100 ° C ). Повторите с другой 20-30 разделов. Подождите, пока вода не испарится и секций придерживаться слайда. Как правило, разделы 3 глаза расположены в три колонки (три глаза) по строкам местечко (сверху / снизу разделов), хорошо ложатся на один слайд. 5. Окрашивание и микроскопический анализ Если секционирования клонов, пятно разделов. Место слайд с разделами на нагревательный блок установлен на уровне 90 ° C. Внесите толуидин-голубого окрашивания раствор из 30 мл шприца придает 0.22μm фильтр на слайд и пятно на 10 секунд. Немедленно промыть широко дистиллированной водой. Воздух сухой. Использование пластиковой пипетки передавать, распространять по 3 капли DPX монтажа среды на слайд и накройте покровным стеклом. Вершина с 3 пятаков и пусть монтажа среду затвердевают (например, на ночь при комнатной температуре). Изображение с светового микроскопа. Использование 5x или 10x объектив, чтобы найти хороший раздел, а затем переключиться на 63x объектив иммерсионного масла для детального анализа и фотографирования. Мы обычно используем настройки фазового контраста, темного поля, но оптика работать. 6. Представитель результаты: Чаще всего, глазами, внедренных в пластик для детального анализа внешней грубой фенотипы глаз определяется как часть генетического экране или в процессе тестирования генетических взаимодействий с генами, как известно, влияют либо общей структуры глаза или полярности. Типичные результаты глаз разделах приведены на рисунке 3. Дикого типа омматидиев (рис. 3) показывают полный фоторецепторов окруженных решетки пигментные клетки. Напротив, в косоглазие (stbm, больше известный как Ван-Гог 7) мутанта, омматидия полярности теряется, и, несмотря на полный фоторецепторов присутствует, вращения и хиральности рандомизированы (рис. 3В). Кроме того, поскольку stbm аллель секционного был в AW – фон, пигментные гранулы отсутствуют на рис. 3B. Рис 3C показывает пример клонального анализа. Дрозофилы Rho киназы (drok) требуется для омматидия вращения, а также для структурной целостности глаз 8. Гомозиготные drok 2 клоны могут быть определены из-за отсутствия пигмента в пигментных клетках и рабдомерами (как правило, клоны индуцированные использованием безглазые-ФЛП и P-элемента с сильно выраженным белым маркерный ген дополняет фоне ш – мутация в дикой природе типа и гетерозиготных ткани). Таким образом, можно выявить мутантный областях их отсутствие пигмента. В связи с клеточной автономии пигментации в R-сеООО упоминалось ранее, генотипов отдельных R-клеток может быть определена (см. стрелки на рис. 3C). Рисунок 1. Глазу дрозофилы является отличной моделью системы для биологов, поскольку, в отличие от гладкой поверхности дикого типа глаз (), поверхность глаза мутанта внешне часто грубой (B), что указывает на основной фенотипом глаз . Во всех фигур, передняя находится слева и спинной вверх. Изображения любезно предоставлены д-р Дженнифер Curtiss, NMSU, Лас-Крусес, NM, США. Рисунок 2. Свет микроскопических изображений одного омматидии секционного помощью описанного метода. Только семь R-клетки видны в то время, в омматидия, так как R7 лежит на верхней части R8. (А, А ') На R7 уровне тела клетки R7 обнаруживается между R1 и R6 (желтые стрелки). В противоположность этому, на уровне R8 (Б), тела клетки R8 обнаружен между R1 и R2 (желтая стрелка в В '). Синие стрелки знак пигментные гранулы, которые могут быть использованы в качестве клеточной автономных пигмента маркером. Рисунок 3. Тангенциальный разделах через дикого типа (А), stbm (Б) и drok (C) мутант взрослые глаза дрозофилы. Схемы ниже разделов указывают полярность омматидиев (см. (А) для стрел). Круги представляют омматидиев с дефектами в фоторецепторных дополнение. Желтая линия спины / вентральной линии симметрии (экватора). В отличие от хорошо ориентированную омматидии дикого типа (А), плоская организация теряется в stbm мутанта (Б). Обратите внимание, что раздел stbm мутанта показано не хватает пигмента из-за его ш – мутант фоне. (C) Потому что drok мутации имеют летальные последствия, они должны быть проанализированы в клонов. Таким образом, пигментные клетки дикого типа или гетерозиготной (заполняется синей стрелки), а R-клеток не хватает пигмента (открытое синее наконечники стрел) гомозиготных мутантов. В дополнение к вращению дефектов, drok мутантов также показывают, структурные дефекты в том числе отсутствие или избыточное количество R-клеток. Заметим, что для клонального анализа, разделы не окрашивали, чтобы избежать затемнения пигментные гранулы.

Discussion

Использование дрозофилы как модельного организма, генетические экранов привело к идентификации многие из членов-основателей семейств генов необходимо для большей части хорошо сохранились и сигнальных путей у высших эукариот, включая человека. Так, в лабораторных условиях, функциональное глаз необязательной для выживания, глаз особенно хорошо подходят ткани для открытия новых функциях генов и оценки генетических сетей. Ультраструктурные анализ летать глаза, используя описанный метод таким образом привели к фундаментальным открытиям, имеющих значение для развития и болезней. Первоначально одной клетки клонального анализ проводили с использованием рентгеновской индуцированных клонов в сочетании с известными тесно связаны клеточной автономных рецессивных маркеров. В последнее время наличие ФЛП / FRT система для создания клонов значительно облегчило фенотипического анализа летальных мутаций в глаза разделов ^6,9.

Анализ глаз разделов не ограничивается тангенциальной разделах описано здесь. При желании, головки могут быть выровнены в любом положении в пресс-форм и поперечные срезы могут быть получены в исследовании более глубоких слоев в голову такие как пластинка и мозгового вещества. Протокол, описанный здесь, таким образом, универсальный метод для анализа глаз и головы структур взрослых дрозофилы.

Materials

General equipment:

• For general fly husbandry see ¹⁰
• Standard dissection microscope (e.g. Nikon SMZ-645 Stereo Zoom Microscope), preferably with a ring light source to prevent casting a shadow of your hands.
• CO₂ Fly pad, covered with 3MM Whatman paper to provide protection against dirt during dissection.
• Gelatin coated slides: dissolve 10g gelatin and 1g CrKSO₄x 12 H₂O in 1L water on a heating plate (bring almost to a boil, takes approximately 2 hrs). Dip well washed (soap) and rinsed (dH₂O) slides in holders into gelatin solution and air-dry covered with foil overnight.
• Heating oven (70°C; old vacuum ovens that were used for nitrocellulose filter drying are well suited for this purpose).
• Microtome capable of ultrathin sectioning (0.5-1 μm thick sections), e.g. those used by electron microscopy facilities. We use a Sorvall MT5000 Ultramicrotome with a Histo quality diamond knife. Glass knives also work.

Fixation solutions:

• Prepare a stock solution of 0.2 M Sodium Phosphate buffer, pH 7.2.
• Prepare 2% glutaraldehyde in 0.1M Sodium Phosphate buffer, pH 7.2 (can be stored at 4°C for 4 weeks). Make at least enough to have 200μl per genotype you want to embed. Keep on ice.
• Osmium solution: 2% OsO₄ in 0.1M Sodium Phosphate buffer, pH 7.2. Make only enough to have 200μl per genotype you want to embed, since the solution cannot be stored. Keep on ice.

Glutaraldehyde and OsO₄ are highly toxic and should be handled with extreme care in a well-ventilated hood. Use filter tips when handling OsO₄ to prevent blackening of your pipette.

Dehydration: Make 30%, 50%, 70%, (80%), 90%, and 100% ethanol solutions. Preferably cool 30%, 50%, 70% ethanol on ice before use.

Staining solution:

1% Toluidine-blue in 1% Borax.

	Soft	Hard
Resin A	54g	50g
Hardener B	44.5g	50g
Accelerator C	2.5g	1.75g
Plasticizer D	10g	0.75g

Table 1. Resin preparation

To prepare the resin, carefully, but thoroughly mix all ingredients in a plastic beaker using a magnetic stirrer with a large stir bar. Avoid bubbles. After mixing, aliquot in standard scintillation vials or similar containers and freeze at -20°C. Use soft resin for all applications unless your EM facility asks for the harder formulation. Use gloves to handle resin (carcinogenic in its unpolymerized form). To polymerize resin on equipment and waste, bake at 70°C overnight. Waste may then be safely discarded and equipment cleaned and reused. Spilled unpolymerized resin can be cleaned with isopropanol.

Reagent	Supplier	Catalog number
Fly pad	e.g. Genesee	59-119
Glutaraldehyde	Sigma	G7526-10 X 10 ML
OsO4	Polysciences,Inc.	0972A-20
Propyleneoxide	Fisher	04332-1
Scalpel handles, for #3	Fisher	22080046
Scalpel blades #11	Fisher	08-916-5B
Transfer pipettes	Fisher	13-711-7M
Durcupan (R) ACM resin	Sigma (Fluka)	44610-1EA
Steel dissecting needle	Fisher	S17346
BEEM flat embedding mold	Electron Microscopy Sci.	70904-12
Teflon coated razor blades	Electron Microscopy Sci.	71970
Q-tip (sterile swabs)	Fisher	14-959-81
Glass slides	Fisher	12-550-143
Cover slips No 1, 22X60 mm	Fisher	12-531K
Gelatin	Fisher	ICN96010280
Cr(III) K SO4 dodecahydrate	Sigma	243361
Diamond Histo knife, 6mm	Diatome US	60-His
Toluidine Blue O	Fisher	BP107-10
Borax (Na-Tetraborate)	Fisher	AC20629-1000
DPX mounting medium	Sigma	44581-100ML

Table 2. Materials