Modélisation Plasma surface de lithographie pour la création des réseaux cellulaires

Summary

Une technique de plasma polyvalent lithographie a été développé pour générer des modèles de surface stable pour orienter l'attachement cellulaire. Cette technique peut être appliquée pour créer des réseaux cellulaires, y compris ceux qui imitent les tissus naturels et a été utilisé pour étudier plusieurs types cellulaires distincts.

Abstract

Manipulation systématique d'un microenvironnement cellulaire avec une résolution de micro-et nano est souvent nécessaire pour déchiffrer les différents phénomènes cellulaires et moléculaires. Pour répondre à cette exigence, nous avons développé une technique de lithographie plasma pour manipuler le microenvironnement cellulaire en créant une surface texturée avec des tailles allant de fonction de 100 nm à quelques millimètres. Le but de cette technique est d'être capable d'étudier, de façon contrôlée, les comportements des cellules individuelles ainsi que des groupes de cellules et de leurs interactions.

Ce procédé de lithographie de plasma est basé sur la modification sélective de la chimie de surface sur un substrat au moyen d'un blindage au contact de basse température du plasma avec un moule physique. Ce blindage sélective laisse un modèle chimique, qui peut guider la fixation des cellules et le mouvement. Ce modèle, ou un modèle de surface, peut ensuite être utilisé pour créer des réseaux de cellules dont la structure peut imiter que l'on trouve dans la nature et produit un environnement contrôlable pour des recherches expérimentales. La technique est bien adaptée à l'étude de phénomènes biologiques car elle produit les modèles de surface stable sur des substrats polymères transparents de manière biocompatible. Les motifs de surface pour la dernière semaine à plusieurs mois et peut ainsi guider l'interaction avec les cellules pendant de longues périodes ce qui facilite l'étude de long terme des processus cellulaires, tels que la différenciation et l'adaptation. La modification de la surface est essentiellement de nature chimique et n'a donc pas d'introduire des interférences topographiques ou physiques pour l'interprétation des résultats. Elle ne comporte pas toutes les substances dures ou toxiques pour atteindre la structuration et est compatible pour la culture de tissus. Par ailleurs, il peut être appliqué à modifier différents types de substrats polymères, ce qui fait de la capacité d'ajuster leurs propriétés sont idéales pour et sont largement utilisés dans des applications biologiques. La résolution atteinte est également bénéfique, comme l'isolation des processus spécifiques comme la migration, l'adhésion, ou de liaison permet d'discrets, des observations claires à la seule au niveau multicellulaire.

Cette méthode a été employée pour former des réseaux divers de différents types de cellules pour les enquêtes impliquant la migration, la signalisation, la formation des tissus, et le comportement et les interactions des neurones mis en accusation dans un réseau.

Protocol

1. Création de moules utilisés pour la modélisation Conception des modèles. Les modèles sont créés qui servent à former des réseaux cellulaires, contacter la cellule de contrôle, d'isoler les cellules, imitent les structures naturelles, ou autrement Guide d'adhésion cellulaire et de placement. Computer-aided design ou la création de CAO basée sur modèle et création de photomasque. Le motif désiré est conçu dans les logiciels de CAO, comme AutoCAD, et est ensuite envoyé à une entreprise extérieure pour la production d'un photomasque. Photolithographie tendance à produire maître. Lames de verre sont modelés soit positif minces résister ou un négatif d'épaisseur résistent en fonction de la taille de la structure ainsi créée. Lames de verre sont utilisées pour leurs avantages d'être à faible coût, plus fort que des plaquettes de silicium et de ne pas produire autant de poussière lorsqu'elles sont brisées. Alternativement, d'autres structures pratiques telles que des réseaux de diffraction peut être utilisé comme le modèle maître. La diapositive motifs est attaché à une pile de diapositives qui n'ont pas été à motifs. Toutes les étapes sont effectuées dans une hotte à flux propre pour minimiser la poussière. Création de moules maître. Un conteneur d'un peu plus grand que la pile de papier d'aluminium diapositives est créé pour contenir les 30 g de polydiméthylsiloxane (PDMS), qui est ensuite versé sur la surface photolithographie motifs pour créer un moule initial. Le PDMS est dégazé et laissé à durcir pendant un à deux jours. Une fois durci le PDMS est décollé du modèle maître et forme un moule pour la prochaine étape. 6 g de 2 époxy partie (# 14310 Devcon (6 g) est mélangé pendant 1 minute et ensuite versé dans le moule maître, dégazé et a permis de guérir. Dégazage l'époxy doit être fait rapidement (<8 min) à l'aide de bulles de nombreuses briser les cycles et en utilisant seulement une fine couche avant de l'époxy durcit et l'enlèvement bulle devient impossible d'enlever les bulles. Le 6 g utilisé produit une couche mince qui facilite l'élimination de bulles rapide. Après une heure, l'époxy partie 2 sera partiellement guéri et plus époxy peut être ajoutée sur le dessus sans dégazage pour produire une structure plus épaisse qui est Easer à manipuler dans les étapes ultérieures. La résine époxyde est ensuite laissé à durcir pendant un à deux jours. Une fois guéri, l'époxy est retiré du moule maître PDMS et la bande est enroulée autour du moule époxy pour former un conteneur. Un moule de travail est alors créé en versant PDMS sur le moule d'époxy, le dégazage du PDMS, et la cure d'un à deux jours. Une fois durci, le moule de travail est décollée de l'époxy et stockés pour maintenir la propreté. 2. Modélisation de surfaces avec des moules pour l'orientation des cellules Petites sections du moule de travail sont découpés et placés sur une boîte de Pétri en polystyrène. Les emplacements de ces sections de moules sont étiquetés. Un trépied est formé à partir des petites sections et pondérées pour assurer le contact entre le moule de conformation de travail et de la surface boîte de Pétri. Bon placement peut être observé en regardant le fond du plat. L'ensemble est placé dans la chambre à plasma. Le traitement plasma est initié et poursuivi à 150 Pa à 29,6 W (puissance maxi) pendant 10 minutes à l'aide de plasma d'air. Après un traitement au plasma, le moule et mise en accusation de poids sont enlevés. La boîte de Pétri est placé sous la lumière UV pour 10 minutes de stérilisation à l'intérieur du cabinet de biosécurité et qui y sont stockées jusqu'à ce ensemencées avec des cellules. 3. L'ensemencement des surfaces avec des cellules Cellules SH-SY5Y CRL-2266 neuroblastome humain ou d'autres sont cultivées en utilisant des protocoles standard pour le type de cellule. Le confluent de la SH-SY5Y CRL-2266 cellules de neuroblastome humain est mesuré visuellement avant l'ensemencement sur la surface à motifs. Fractionnement cellulaire standard est effectué pour éliminer les cellules de la surface de leur boîte de Pétri. Les cellules, flottant une fois libres, sont ensemencées sur la surface du plat à motifs de Petri après avoir été dilué pour atteindre la confluence désiré lorsqu'il est placé sur la surface à motifs. Les cellules sont autorisés à s'établir et à fixer à la surface. Le plat à motifs de Pétri est incubée pendant plusieurs heures à plusieurs jours tandis que les cellules montons sur le motif créé par le plasma. Lorsque la culture de cellules de neuroblastome l', l'acide rétinoïque (10 M) est ajouté quotidiennement afin d'induire les cellules à se différencier en un état neurone-like. L'addition de l'acide rétinoïque est fait dans l'obscurité. L'acide rétinoïque est ajouté quotidiennement pendant plusieurs jours, après laquelle la différenciation sera observable. Media est remplacé tous les 3-4 jours. 4. L'observation et l'analyse Images périodique des cellules vivantes ou des vidéos sont prises afin d'observer le comportement des cellules au cours du temps. Pour les images en direct, les cellules sont placées dans une platine de microscope dessus incubateur qui maintient les cellules à 37 ° C CO, 100% d'humidité, et 5% 2. Les cellules peuvent également être fixés et colorés pour l'observation en fluorescence <li> Les images ou les vidéos des cellules qui ont été capturés sont importées à un système d'analyse d'image et mesures sont effectuées, y compris le taux de croissance, la taille des cellules, la vitesse de migration, la différenciation, l'alignement, la localisation des protéines spécifiques, et d'autres. 5. Les résultats représentatifs: Un résultat typique d'application de la technique de lithographie plasma est la formation d'un modèle de cellules qui ressemble à une certaine structure arbitraire ou naturel. Cela se voit dans la figure 1a-b où lignes et réseaux de neurones ont été créés. D'autres types cellulaires peuvent être utilisés ainsi que le montre la figure 1c-d, ce qui montre l'homme des cellules endothéliales de veine ombilicale (HUVEC) et les cellules musculaires squelettiques C2C12 formant des grilles. Des matériaux tels que le poly-L-lysine peut aussi être modelée, figure 1E pour faciliter la fixation de certains types cellulaires et pour autres usages. Dans le cas des neurones montré, ce qui a été créé des réseaux de cellules qui ont des connexions entre eux. Cela reproduit ce qui se passe naturellement dans le cerveau où les neurones ont des liens discrets entre cellules voisines qui influe sur le fonctionnement du cerveau. Avec la création d'une telle structure dans le laboratoire, le nombre, la position, la fréquence et d'autres facteurs de connexions peuvent être systématiquement contrôlés. Le résultat de ces mises en accusation peut être mesurée visuellement et entrées supplémentaires, tels que produits chimiques ou la stimulation électrique peut être mis en œuvre pour sonder le comportement du réseau. Un résultat négatif serait un motif de envahis ou incomplètes, ou un échantillon contaminé. Un motif incomplet ou envahies résulterait de l'ensemencement du substrat avec soit des cellules trop peu ou trop nombreuses, qui ne fournirait pas le motif avec une quantité idéale de cellules. De plus, si le modèle n'est pas conçu correctement (par exemple, les lignes trop étroites), les cellules ne sera pas en mesure d'attacher et de se développer avec succès sur elle. Dans le cas d'un échantillon contaminé, la propreté correcte n'aurait pas été maintenu pendant une des étapes si cela est rare quand on suit le protocole de culture cellulaire appropriée en raison du fait que la structuration du plasma stérilise aussi le substrat. Figure 1. Modélisation des cellules et des protéines.

Discussion

La méthode d'investigation de cellule présentée ici permet de créer des motifs complexes de réseaux multicellulaires qui imitent les structures biologiques aussi bien que fournit une méthode pour produire des stimuli qui sont subcellulaire dans la nature qui facilite ensuite les enquêtes sur le comportement des cellules à la fois groupés et les réponses des cellules simples à des facteurs environnementaux. L'utilisation de cette méthode est simple mais robuste car il peut être rapidement réalisée avec du matériel à faible coût dans le même laboratoire que la culture cellulaire. Il est également fortement cellulaires sensibles, permet d'observer facilement le comportement et la résultante est par nature stable pour de longues périodes, ce qui permet l'étude du comportement des cellules à long terme. Il permet en outre d'une gamme diverse d'expériences à réaliser car il est compatible avec de nombreux types cellulaires et peuvent créer des motifs arbitraires. La stabilité à long terme de la technique provient du fait que la fonctionnalisation de surface transmise par le plasma fait partie de la surface et n'est pas un enduit ou autre couche qui peut être enlevé ou dégradés. S'il est gardé sous liquide, ce type de modification peut conserver sa capacité de cellules directeurs des mois.

La partie la plus critique de l'expérience nécessaires pour garantir des résultats significatifs est celui de créer le schéma directeur qui sera finalement utilisé pour le guidage cellulaire. Si cette tendance n'est pas bien conçu, les cellules ne sera pas appropriée de répondre aux tendances et ne peuvent pas produire un comportement utile. Des paramètres tels que la largeur de ligne, l'espacement modèle, et d'autres peuvent influencer grandement la compatibilité des cellules avec un modèle particulier, et généralement toute une série de paramètres peuvent être créés sur le photomasque initiale à l'écran pour la conception la plus appropriée.

D'autres paramètres importants liés à la réalisation de motifs comprennent la création du moule, le maintien d'un environnement sans poussière, l'ensemencement de cellules et de la stérilité générale de la culture cellulaire. Création de la moisissure peut être effectuée par les étapes de transfert différentes, qui sont entrepris pour permettre répétées PDMS de larguer les amarres un moule epoxy. Le moule epoxy est créé, car il ne se dégrade pas de la même manière comme une résister à la moisissure avec de petites structures de haute ratio d'aspect sous casting répétée. Si le moulage par transfert est fait correctement, les dimensions et le rendement ne sera pas affecté, mais si mal fait par exemple en mal de dégazage, séchage incomplet, ou chauffage excessif, les bulles, la rugosité et la déformation d'un modèle peut se produire qui affecte le résultat final. En ce qui concerne le maintien d'un environnement sans poussière, les moules doivent être aussi propres que possible, car toute la poussière peuvent interférer avec le bon contact entre le moule travailler PDMS et la surface du plasma et donc bon blindage et la structuration des produits chimiques. La densité d'ensemencement de cellules doit également être optimisés afin d'assurer que ni trop peu de cellules ou d'un trop grand nombre habitent la région modèle et la stérilité doit être maintenue pour éviter la contamination bactérienne et d'autres des cellules utilisées.

La technique peut aussi être incorporés à d'autres éléments comme la microfluidique, des microélectrodes, et des sondes mécaniques. Cela fournit des stimuli additionnels pour les cellules afin de mieux reproduire les différentes conditions physiologiques lors de l'expérimentation et les travaux futurs se concentre sur l'étude des effets de ces combinaisons

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Plasma Cleaner And Vacuum Chamber	Harrick Plasma	PDC-001
Inverted fluorescence and phase contrast microscope	Nikon	TE2000-U
Microscope stage top incubator	AmScope	Model TCS-100	Modified to include an enclosure that supplies an appropriate atmosphere
Polystyrene Petri dish	VWR	25384-090
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	Sylgard 184
Epoxy	Devcon	2 ton clear epoxy #14310
Cell culture media	Various		Media follows standard formulations for cell type
Retinoic acid	Sigma	R2625