استخدام اعتراض البصرية لدراسة التفاعلات المرضي المضيف الحيوي للخلية الحية التصوير
Summary
ووصف طريقة لتحديد فردي ، والتعامل معها ، ومسببات الأمراض الصورة الحية باستخدام فخ البصرية بالإضافة إلى المجهر القرص الغزل. فخ البصرية يوفر سيطرة المكاني والزماني للكائنات الحية والأماكن المجاورة لها إلى الخلايا المضيفة. مضان المجهري التفاعلات بين الخلايا الحيوية يلتقط مع الحد الأدنى من اضطراب في الخلايا.
Abstract
ديناميكية التصوير الخلية الحية تسمح برؤية مباشرة في الوقت الحقيقي التفاعلات بين خلايا الجهاز المناعي 1 ، 2 ، إلا أن عدم السيطرة المكانية والزمانية بين الخلية البلعمية وميكروب جعلت ركزت الملاحظات في التفاعلات الأولية للاستجابة المضيف لمسببات الأمراض صعبة. تاريخيا ، تم تصوير أحداث الاتصال بين الخلايا مثل البلعمة 3 عن طريق خلط أنواع الخلايا اثنين ، ثم المسح الميداني مستمر من رأي لايجاد اتصالات بين الخلايا الصدفة في المرحلة المناسبة للتفاعل. الطبيعة العشوائية لهذه الأحداث يجعل هذه عملية شاقة ، وأنه من الصعب مراقبة الأحداث في وقت مبكر أو عابرة في الخلية خلية الاتصال عن طريق هذا النهج. هذا الأسلوب يتطلب العثور على أزواج الخلية التي هي على وشك الاتصال ، والمراقبة لهم حتى الاتصال بهم من الطراز الأول ، أو لا. لمعالجة هذه القيود ، ونحن نستخدم محاصرة الضوئية كوسيلة من وسائل ، غير الغازية غير مدمرة ، ولكن سريعة وفعالة لوضع الخلايا في الثقافة.
ويتزايد استخدام المصائد الضوئية ، أو ملاقط بصرية ، في مجال البحوث البيولوجية لالتقاط والتلاعب جسديا الخلايا والجزيئات الأخرى ميكرون الحجم في ثلاثة أبعاد 4. ولوحظ تكثيف الضغط الإشعاع وتطبيقها لنظم منتاش البصرية في عام 1970 5 ، 6 ، وكان أول استخدام للسيطرة على العينات البيولوجية في عام 1987 7. منذ ذلك الحين ، قد نضجت ملاقط بصرية في التكنولوجيا لتحقيق مجموعة متنوعة من الظواهر البيولوجية 8-13.
نحن تصف طريقة السلف ال 14 التي يعيش التصوير من خلال دمج الخلايا الضوئية مع اعتراض الغزل المجهري القرص مبائر مع التحكم في درجة الحرارة والرطوبة لتوفير مجموعة رائعة والسيطرة المكانية والزمانية من الكائنات الممرضة في البيئة الفسيولوجية لتسهيل التفاعل مع الخلايا المضيفة ، على النحو الذي يحدده المشغل. العيش ، وحوصر بصريا الكائنات المسببة للأمراض مثل المبيضات البيض والرشاشية الدخناء ، الذي يمكن أن يسبب يمكن أن تكون مميتة ، والتهابات الغازية في الأفراد المناعة 15 و 16 (مثل الإيدز ، والعلاج الكيميائي ، ومرضى زرع الأعضاء) ، وذلك باستخدام الليزر كثافات غير المدمرة وانتقل بجوار الضامة ، والتي يمكن يبلعم الممرض. وارتفاع القرار ، أحالت الأفلام الخفيفة ومضان القائم على أسس القدرة على مراقبة الأحداث في وقت مبكر من البلعمة في الخلايا الحية. للتدليل على تطبيق واسعة في علم المناعة ، كما حوصر الأولية (خلايا تي) والتلاعب في شكل نقاط الاشتباك العصبي المضادة للCD3 المجهرية المغلفة في الجسم الحي ، وكما تم الحصول على الوقت الفاصل بين التصوير تشكيل المشبك. من خلال توفير وسيلة لبسط السيطرة المكانية غرامة مسببات العيش فيما يتعلق الخلايا المناعية ، ويمكن التقاط التفاعلات الخلوية بواسطة المجهر مضان مع الحد الأدنى من اضطراب الخلايا ويمكن أن تسفر عن بصيرة قوية في وقت مبكر من ردود الحصانة الفطرية والتكيفية.
Protocol
Discussion
في هذا العمل الذي نقوم استخدام فخ البصرية لالتقاط الجراثيم ذات أبعاد ما بين 3 ميكرون — 5 ميكرون. على الرغم من مسببات الأمراض التي تهم مختبرنا وعادة ما يكون لهذه الأبعاد ، ونظام منتاش البصرية الموصوفة هنا هي مرنة إلى اعتراض مجموعة واسعة من الأحجام. وقد استخدمت بالفعل ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من مستشفى ماساتشوستس الإدارة العامة للصناديق الطب الباطني (JMT ، MKM ، حركة تحرير الكونغو ، JMV) ، المعهد الوطني للتصوير الطبية الحيوية ومنح الهندسة الحيوية T32EB006348 (CEC) ، ومركز مستشفى ماساتشوستس العام للالحاسوبية والتكاملية الأحياء صندوق التنمية وAI062773 ( RJH) ، ومنح AI062773 ، DK83756 وDK 043351 (RJX) ، جبهة الخلاص الوطني 0643745 (MJL) ، NIH R21CA133576 (MJL) ، والمعهد الوطني لأمراض الحساسية والأمراض المعدية التابع لمعاهد الصحة القومية (NIH) AI057999 (JMV ). نشكر نيكولاس جيم يودر لإجراء مناقشات مفيدة ، وتشارلز لباد (RPI ، المؤتمر الوطني العراقي) للحصول على المساعدة التقنية.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| A. fumigatus | Albino strain, B-5233/RGD12-8, gift from K.J. Kwon-Chung, NIH | ||
| C. albicans | SSY50-B mutant, gift from Eleftherios Mylonakis, MGH; SC5314 strain, gift from Gerald Fink, Whitehead Institute | ||
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A20000 | |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A20006 | |
| dimethylformamide | Sigma | D4551 | |
| Fresh blood | Gift from R.J.W. Heath, MGH, HMS | ||
| Nikon inverted microscope | Nikon | Model Ti-E | |
| Trapping laser, ChromaLase | Blue Sky Research | CLAS-106-STF02-02 | |
| Fluorescence excitation laser | Coherent | Model Innova 70C | |
| Breadboards for trapping components | Thorlabs | MB1224, MB1218 | |
| Optical air table | Technical Manufacturing Corporation | ||
| Electronic shutter with pedal control | Uniblitz | Purchased from Vincent Associates, Rochester, NY | |
| Singlemode optical fiber | Oz Optics | PMJ-3S3S-1064-6 | |
| Fiber positioner | Thorlabs | PAF-X-5-C | |
| Fiber collimator | Oz Optics | HPUCO-23-1064-P-25AC | |
| Lenses for telescope | Thorlabs | AC254-150-B | Focal length of 150 mm |
| Translation stages (x, y, z) | Newport | M-461-XYZ | |
| IR dichroic mirror | Chroma | ET750-sp-2p8 | |
| Objective lens (100X) | Nikon | NA = 1.49, oil immersion, TIRF objective | |
| Confocal head | Yokogawa | CSU-XI | |
| Polarizer | Nikon | MEN51941 | |
| Wollaston prism | Nikon | MBH76190 | |
| EM-CCD camera | Hamamatsu | C9100-13 | |
| CCD camera (ORCA ER) | Hamamatsu | C4742-80-12AG | |
| Filter wheel | Ludl | 99A353 | |
| Filter wheel | Sutter | LB10-NWE | |
| Chambered coverglass | Lab-Tek/Nunc | 155409 | |
| Dynabeads | Invitrogen | 111-51D | Coated with anti-CD3 |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Invitrogen/Gibco | 10313 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen/Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine | Invitrogen/Gibco | 25030-081 | |
| Fetal Bovine Serum (HyClone) | ThermoScientific | SH30071.03 |
References
- Grakoui, A. The immunological synapse: A molecular machine controlling T cell activation. Science. 285, 221-227 (1999).
- Monks, C. R. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
- Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. Phagocytosis and comparative innate immunity: Learning on the fly. Nat Rev Immunol. 8, 131-141 (2008).
- Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Rev Sci Instrum. 75, 2787-2809 (2004).
- Ashkin, A. Optical trapping and manipulation of neutral particles using lasers. Proc Natl Acad Sci USA. 94, 4853-4860 (1997).
- Ashkin, A. Acceleration and trapping of particles by radiation pressure. Phys Rev Lett. 24, 156-159 (1970).
- Ashkin, A., Dziedzic, J. Optical trapping and manipulation of viruses and bacteria Science. Nature. 235, 1517-1520 (1987).
- Khalil, A. S. Single M13 bacteriophage tethering and stretching. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 4892-4897 (2007).
- Khalil, A. S. Kinesin’s cover-neck bundle folds forward to generate force. Proc Natl Acad Sci USA.. 105, 19247-19252 (2008).
- Li, Z. Membrane tether formation from outer hair cells with optical tweezers. Biophys J. , 1386-1395 (2002).
- Kim, S. The αβ T cell receptor is an anisotropic mechanosensor. J Biol Chem. 284, 31028-31028 (2009).
- Mohanty, S., Mohanty, K., Gupta, P. Dynamics of interaction of RBC with optical tweezers. Opt. Express. 13, 4745-4751 (2005).
- Tam, J. Control and manipulation of pathogens with an optical trap for live cell imaging of intercellular interactions. PLoS One. 5, e15215-e15215 (2010).
- Lin, S. J., Schranz, J., Teutsch, S. M. Aspergillosis case-fatality rate: Systematic review of the literature. Clin Infect Dis.. 32, 358-366 (2001).
- Wey, S. B. Hospital-acquired candidemia – the attributable mortality and excess length of stay. Arch. Intern. Med. 148, 2642-2645 (1988).
