Profiling Voltage-gated Potassium Channel-mRNA Expression in nigralen Neuronen mit Einzel-Zell RT-PCR-Techniken
Summary
Neuronen sind zunächst geprägt elektrophysiologisch. Dann das Zytoplasma aus den aufgezeichneten Neuronen wird abgesaugt und einer Transkription-PCR-Analyse umzukehren, um die Expression von mRNAs für Neurotransmitter-Synthese-Enzyme, Ionenkanäle und Rezeptoren zu erkennen.
Abstract
In zentralen Nervensystem von Säugetieren, sind verschiedene Typen von Neuronen mit verschiedenen molekularen und funktionellen Eigenschaften miteinander, nur schwer zu trennen und auch nicht einfach durch ihre Morphologie identifiziert vermischt. So ist es oft schwierig, die Genexpression in einem bestimmten Neuron Art zu analysieren. Hier dokumentieren wir ein Verfahren, whole-cell Patch-Clamp-Aufnahmetechnik kombiniert mit Single-Cell-Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (SCRT-PCR) zum Profil mRNA-Expression in verschiedenen Typen von Neuronen in den wesentlichen nigra. Elektrophysiologische Techniken werden zuerst auf die neurophysiologischen und funktionellen Eigenschaften der einzelnen Nervenzellen aufnehmen. Dann wird das Cytoplasma einzelner elektrophysiologisch charakterisiert nigral Neuronen abgesaugt und einer SCRT-PCR-Analyse zur mRNA-Expression-Profile für Neurotransmitter-Synthese-Enzyme, Rezeptoren und Ionenkanäle erhalten. Die hohe Selektivität und Sensitivität machen diese Methode besonders nützlich, wenn Immunhistochemie nicht aufgrund eines Mangels an geeigneten Antikörper oder niedrige Expression des Proteins verwendet werden. Diese Methode ist auch anwendbar auf Neuronen in anderen Hirnregionen.
Protocol
Discussion
Die Kombination von Patch-Clamp-Aufzeichnung in Hirnschnitt mit SCRT-PCR haben wir gezeigt, hier bieten eine hervorragende Methode, um die mRNA-Expression-Profile für Ionenkanäle, Rezeptoren und Schlüsselenzyme für Neurotransmittersynthese in individuell charakterisiert Neuronen zu untersuchen. Dies ist besonders nützlich, wenn das Protein in Frage nicht erkannt und lokalisiert werden mit anderen Methoden wie Immunhistochemie durch niedrige Expression und / oder mangels geeigneter Antikörper (Surmeier et al 1996;….
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom NIH gewährt R01DA021194 und R01NS058850 unterstützt.
Materials
Table 1. Key reagents and equipment
Table 2. Primer pairs for rat neuronal Kv3 channel, tyrosine hydroxylase (TH) and glutamic acid decarboxylase 1 (GAD1) mRNAs for scRT-PCR
Referências
- J, . Tuning pacemaker frequency of individual dopaminergic neurons by Kv4.3L and Kchip3.1 transcription. EMBO J. 20, 5715-5724 (2001).
- Surmeier, D. J., Song, W. J., Yan, Z. Coordinated expression of dopamine receptors in neostriatal medium spiny neurons. J. Neurosci. 16, 6579-6591 (1996).
- Zhou, F. W., Matta, S. G., Zhou, F. -. M. Constitutively active TRPC3 channels regulate basal ganglia output neurons. J. Neurosci. 28, 473-482 (2008).
- Zhou, F. W., Jin, Y., Matta, S. G., Xu, M., Zhou, F. -. M. An ultra-short dopamine pathway regulates basal ganglia output neurons. J. Neurosci. 29, 10424-10435 (2009).
- Ding, S., Matta, S. G., Zhou, F. -. M. Kv3-like potassium channels are required for sustained high-frequency firing in Basal Ganglia output neurons. J. Neurophysiol. 105, 554-570 (2011).
- Zhou, F. W., Xu, J. J., Zhao, Y., Ledoux, M. S., Zhou, F. -. M. Opposite functions of histamine H1 and H2 receptors and H3 receptors in substantia nigra pars reticulata. J. Neurophysiol. 96, 1581-1591 (2006).
