פרופיל Voltage-Expression מגודרת אשלגן mRNA ערוץ בנוירונים Nigral באמצעות תא יחיד RT-PCR טכניקות
Summary
נוירונים מאופיינים first electrophysiologically. ואז הציטופלסמה של תא העצב המוקלט aspirated וכפופים להפוך שעתוק-PCR ניתוח כדי לזהות את הביטוי של mRNAs לסינתזה אנזימים הנוירוטרנסמיטר, תעלות יונים, ואת הקולטנים.
Abstract
במערכת העצבים המרכזית, יונקים, סוגים שונים של נוירונים עם מאפיינים מולקולרית ופונקציונלית מגוונים הם התערבבו זה עם זה, קשה להפריד וגם לא מזוהה בקלות על ידי המורפולוגיה שלהם. לכן, לעיתים קרובות קשה לנתח ביטוי גנים בסוג נוירון ספציפי. כאן אנחנו המסמך הליך המשלב כל תא מהדק תיקון טכניקות הקלטה עם תא בודד polymerase תגובת שרשרת הפוכה שעתוק (scRT-PCR) ביטוי mRNA פרופיל סוגים שונים של נוירונים nigra משמעותי. טכניקות אלקטרו משמשים הראשון להקליט את המאפיינים neurophysiological ופונקציונלי של נוירונים בודדים. ואז, הציטופלסמה של נוירונים בודדים nigral מאופיין electrophysiologically הוא aspirated ו נתון ניתוח scRT-PCR לקבל ביטוי פרופילים mRNA לסינתזת אנזימים הנוירוטרנסמיטר, קולטנים, ואת תעלות יונים. הסלקטיביות רגישות גבוהה ולעשות שיטה זו שימושית במיוחד כאשר אימונוהיסטוכימיה לא ניתן להשתמש בשל חוסר של נוגדנים מתאימים או רמת ביטוי נמוכה של החלבון. שיטה זו היא גם החלים על הנוירונים באזורים אחרים במוח.
Protocol
Discussion
השילוב של הקלטה תיקון מהדק ב פרוסה המוח עם scRT-PCR הראינו כאן לספק שיטה מצוינת לחקור את ביטוי ה-mRNA פרופילים עבור תעלות יונים, קולטנים, ואנזימים מפתח לסינתזה הנוירוטרנסמיטר בנוירונים מאופיין בנפרד. תכונה זו שימושית במיוחד כאשר החלבון המדובר לא ניתן לאתר מקומי בשיטות אחר…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקים R01DA021194 ו R01NS058850.
Materials
Table 1. Key reagents and equipment
Table 2. Primer pairs for rat neuronal Kv3 channel, tyrosine hydroxylase (TH) and glutamic acid decarboxylase 1 (GAD1) mRNAs for scRT-PCR
References
- J, . Tuning pacemaker frequency of individual dopaminergic neurons by Kv4.3L and Kchip3.1 transcription. EMBO J. 20, 5715-5724 (2001).
- Surmeier, D. J., Song, W. J., Yan, Z. Coordinated expression of dopamine receptors in neostriatal medium spiny neurons. J. Neurosci. 16, 6579-6591 (1996).
- Zhou, F. W., Matta, S. G., Zhou, F. -. M. Constitutively active TRPC3 channels regulate basal ganglia output neurons. J. Neurosci. 28, 473-482 (2008).
- Zhou, F. W., Jin, Y., Matta, S. G., Xu, M., Zhou, F. -. M. An ultra-short dopamine pathway regulates basal ganglia output neurons. J. Neurosci. 29, 10424-10435 (2009).
- Ding, S., Matta, S. G., Zhou, F. -. M. Kv3-like potassium channels are required for sustained high-frequency firing in Basal Ganglia output neurons. J. Neurophysiol. 105, 554-570 (2011).
- Zhou, F. W., Xu, J. J., Zhao, Y., Ledoux, M. S., Zhou, F. -. M. Opposite functions of histamine H1 and H2 receptors and H3 receptors in substantia nigra pars reticulata. J. Neurophysiol. 96, 1581-1591 (2006).
