Profiling Voltage-gated kalium kanaal mRNA expressie in Nigral Neuronen met behulp van Single-cell RT-PCR-technieken
Summary
Neuronen zijn in de eerste elektrofysiologische gekarakteriseerd. Dan het cytoplasma van de opgenomen neuron is opgezogen en onderworpen aan transcriptie-PCR analyse achteruit om de expressie van mRNA's voor de neurotransmitters synthese enzymen, ion kanalen en receptoren op te sporen.
Abstract
In centrale zenuwstelsel, zijn verschillende soorten neuronen met verschillende moleculaire en functionele eigenschappen vermengd met elkaar, moeilijk te scheiden en ook niet gemakkelijk te herkennen aan hun morfologie. Zo is het vaak moeilijk om genexpressie te analyseren in een specifiek neuron type. Hier hebben we een document procedure die whole-cell patch clamp opnamen technieken combineert met een single-cell reverse transcriptie polymerase chain reaction (scRT-PCR) naar het profiel van mRNA expressie in verschillende types van neuronen in de grote nigra. Elektrofysiologische technieken worden voor het eerst gebruikt om de neurofysiologische en functionele eigenschappen van individuele neuronen te nemen. Dan is het cytoplasma van een elektrofysiologische gekenmerkt nigral neuronen afgezogen en onderworpen aan scRT-PCR-analyse mRNA-expressie profielen te verkrijgen voor neurotransmitters synthese enzymen, receptoren en ionkanalen. De hoge selectiviteit en gevoeligheid maakt deze methode met name handig als immunohistochemie kan niet te wijten aan een gebrek aan geschikte antilichaam of lage expressie-niveau van het eiwit worden gebruikt. Deze methode is ook toepasbaar op neuronen in andere hersengebieden.
Protocol
Discussion
De combinatie van patch clamp opnamen in de hersenen slice met scRT-PCR toonden we hier een uitstekende methode om de mRNA-expressie-profielen te onderzoeken voor de ion kanalen, receptoren, en de belangrijkste enzymen voor neurotransmitters synthese in individueel gekarakteriseerd neuronen. Dit is vooral handig wanneer het eiwit in kwestie niet kan worden gedetecteerd en gelokaliseerd met behulp van andere methoden zoals immunohistochemie te wijten aan lage expressie-niveau en / of gebrek aan geschikte antilichaam (Sur…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NIH beurzen R01DA021194 en R01NS058850.
Materials
Table 1. Key reagents and equipment
Table 2. Primer pairs for rat neuronal Kv3 channel, tyrosine hydroxylase (TH) and glutamic acid decarboxylase 1 (GAD1) mRNAs for scRT-PCR
References
- J, . Tuning pacemaker frequency of individual dopaminergic neurons by Kv4.3L and Kchip3.1 transcription. EMBO J. 20, 5715-5724 (2001).
- Surmeier, D. J., Song, W. J., Yan, Z. Coordinated expression of dopamine receptors in neostriatal medium spiny neurons. J. Neurosci. 16, 6579-6591 (1996).
- Zhou, F. W., Matta, S. G., Zhou, F. -. M. Constitutively active TRPC3 channels regulate basal ganglia output neurons. J. Neurosci. 28, 473-482 (2008).
- Zhou, F. W., Jin, Y., Matta, S. G., Xu, M., Zhou, F. -. M. An ultra-short dopamine pathway regulates basal ganglia output neurons. J. Neurosci. 29, 10424-10435 (2009).
- Ding, S., Matta, S. G., Zhou, F. -. M. Kv3-like potassium channels are required for sustained high-frequency firing in Basal Ganglia output neurons. J. Neurophysiol. 105, 554-570 (2011).
- Zhou, F. W., Xu, J. J., Zhao, Y., Ledoux, M. S., Zhou, F. -. M. Opposite functions of histamine H1 and H2 receptors and H3 receptors in substantia nigra pars reticulata. J. Neurophysiol. 96, 1581-1591 (2006).
