Profiling di potassio voltaggio-dipendenti espressione di mRNA nei neuroni Canale nigral con singola cella di RT-PCR Tecniche
Summary
I neuroni vengono prima caratterizzata elettrofisiologico. Poi il citoplasma dal neurone registrato è aspirato e sottoposto a trascrizione inversa-PCR per rilevare l'espressione di mRNA per la sintesi degli enzimi dei neurotrasmettitori, canali ionici e recettori.
Abstract
Nel sistema nervoso centrale dei mammiferi, i diversi tipi di neuroni con diverse caratteristiche molecolari e funzionali sono mescolate tra loro, difficili da separare e anche non facilmente identificabili per la loro morfologia. Così, è spesso difficile analizzare l'espressione genica in un tipo specifico neurone. Qui documento di una procedura che combina a cellula intera tecniche di registrazione di patch clamp con cella singola invertire reazione a catena della polimerasi della trascrizione (SCRT-PCR) per profilo di espressione di mRNA in diversi tipi di neuroni nel nigra sostanziale. Tecniche elettrofisiologiche vengono prima utilizzate per registrare le proprietà neurofisiologiche e funzionali dei singoli neuroni. Poi, il citoplasma di singoli neuroni elettrofisiologico caratterizzato nigral è aspirato e sottoposto a SCRT-PCR per ottenere profili di espressione di mRNA per la sintesi degli enzimi dei neurotrasmettitori, recettori e canali ionici. L'elevata selettività e sensibilità rendono questo metodo particolarmente utile quando l'immunoistochimica non può essere utilizzata a causa della mancanza di anticorpi adatti o basso livello di espressione della proteina. Questo metodo è applicabile anche a neuroni in altre aree cerebrali.
Protocol
Discussion
La combinazione di registrazione patch clamp in fetta cervello con SCRT-PCR abbiamo dimostrato qui fornire un metodo eccellente per studiare i profili di espressione dell'mRNA per canali ionici, recettori ed enzimi chiave per la sintesi dei neurotrasmettitori in neuroni individualmente caratterizzato. Ciò è particolarmente utile quando la proteina in questione non può essere rilevato e localizzato utilizzando altri metodi, come l'immunoistochimica a causa di bassi livelli di espressione e / o mancanza di anti…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni NIH R01DA021194 e R01NS058850.
Materials
Table 1. Key reagents and equipment
Table 2. Primer pairs for rat neuronal Kv3 channel, tyrosine hydroxylase (TH) and glutamic acid decarboxylase 1 (GAD1) mRNAs for scRT-PCR
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