Neurônios são os primeiros caracterizada eletrofisiologicamente. Em seguida, o citoplasma do neurônio gravado é aspirado e submetido a transcrição reversa-PCR para detectar a expressão de mRNAs de enzimas neurotransmissor síntese, canais iônicos e receptores.
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Artigo de método
Perfil de tensão-gated Expressão mRNA canais de potássio em neurônios da substância negra usando uma única célula RT-PCR Técnicas
Neste artigo
Resumo
Resumo
No sistema central de mamíferos nervoso, diferentes tipos de neurônios com diversas características moleculares e funcionais são misturados uns com os outros, difícil separar e também não são facilmente identificados pela sua morfologia. Assim, é muitas vezes difícil de analisar a expressão de gene em um tipo de neurônio específico. Aqui nós documentamos um procedimento que combina de célula inteira correção técnicas de gravação de fixação com uma única célula reverter reação em cadeia da polimerase (SCRT-PCR) para expressão de mRNA perfil em diferentes tipos de neurônios no nigra substancial. Técnicas eletrofisiológicas são utilizados pela primeira vez para registrar as propriedades neurofisiológicas e funcionais de neurônios individuais. Então, o citoplasma de uma única eletrofisiologicamente caracterizada neurônios da substância negra é aspirado e submetido a SCRT-PCR para obter perfis de expressão de RNAm para as enzimas de síntese de neurotransmissores, receptores e canais iônicos. A alta seletividade e sensibilidade tornam este método particularmente útil quando imunohistoquímica não pode ser usado devido à falta de anticorpos adequado ou baixo nível de expressão da proteína. Este método também é aplicável aos neurônios em outras áreas do cérebro.
Protocolo
1. Preparação fatia do cérebro
- Jovens (15-40 dias de idade) do sexo masculino e feminino Sprague-Dawley são usados. (Nós também usamos esse mesmo protocolo em camundongos.) Sob anestesia profunda de uretano, os animais são decapitados eo cérebro é rapidamente dissecados. De 300 m de espessura fatias do cérebro que contém a parte coronal midrostral da substantia nigra são cortados em um vibratome Leica (VT-1200S). A fatia de corte procedimento é realizado em uma gelada, sacarose oxigenado alta corte solução contendo (em mM): 220 sacarose, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 25 NaHCO 3, 0,5 CaCl 2, 7 MgCl 2, 10 D-....
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Discussão
A combinação de gravação de patch-clamp na fatia do cérebro com SCRT-PCR demonstramos aqui fornecem um excelente método para investigar os perfis de expressão de RNAm para canais iônicos, receptores e enzimas-chave para a síntese de neurotransmissores nos neurônios individualmente caracterizado. Isso é particularmente útil quando a proteína em questão não podem ser detectadas e localizadas através de outros métodos, tais como imunohistoquímica, devido ao nível de baixa expressão e / ou falta de anticorpos adequado (Surm.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo NIH concede R01DA021194 e R01NS058850.
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Materiais
Tabela 1. Reagentes e equipamentos chave
Tabela 2. Pares de primers para rato canal Kv3 neuronal, tirosina hidroxilase (TH) e descarboxilase do ácido glutâmico 1 (GAD1) mRNAs para SCRT-PCR
Referências
- J, Tuning pacemaker frequency of individual dopaminergic neurons by Kv4.3L and Kchip3.1 transcription. EMBO J. 20, 5715-5724 (2001).
- Surmeier, D. J., Song, W. J., Yan, Z. Coordinated expression of dopamine receptors in neostriatal medium spiny ne....
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Reimpressões e permissões
