Profilering spänningskänsliga Kalium Expression Kanal mRNA i Nigral nervceller med hjälp av encelliga RT-PCR-teknik
Summary
Neuroner är första kännetecknas elektrofysiologi. Då cytoplasman från den inspelade neuron sugs och utsätts för omvänd transkription-PCR-analys för att upptäcka uttryck för mRNA för enzymer neurotransmittorer syntes, jonkanaler och receptorer.
Abstract
I däggdjur centrala nervsystemet, är olika typer av nervceller med olika molekylära och funktionella egenskaper blandas med varandra, svårt att separera och inte heller lätt identifieras genom sin morfologi. Därför är det ofta svårt att analysera genuttryck i en viss nervcell typ. Här dokumenterar vi en procedur som kombinerar helcells-patch tekniker klämma inspelning med encelliga omvänd transkription polymeraskedjereaktion (SCRT-PCR) för att profilera mRNA uttryck i olika typer av nervceller i stora nigra. Elektrofysiologiska tekniker är först används för att registrera neurofysiologiska och funktionella egenskaper hos enskilda nervceller. Då är cytoplasman av enstaka elektrofysiologiskt kännetecknas nigral nervceller aspirerade och utsätts för SCRT-PCR-analys för att få profiler mRNA uttryck för enzymer neurotransmittor syntes, receptorer och jonkanaler. Den hög selektivitet och hög känslighet gör denna metod särskilt användbar när immunohistokemi inte kan användas på grund av brist på lämpliga antikroppar eller låg uttryck nivån av proteinet. Denna metod är också tillämplig på nervceller i andra områden i hjärnan.
Protocol
Discussion
Kombinationen av patch clamp inspelning i hjärnan skiva med SCRT-PCR vi visat här ger en utmärkt metod för att undersöka profilerna mRNA uttryck för jonkanaler, receptorer och viktiga enzymer för neurotransmittorn syntes i individuellt präglas nervceller. Detta är särskilt användbart när proteinet i fråga inte kan upptäckas och lokaliseras med hjälp av andra metoder såsom immunohistokemi på grund av låg uttryck nivå och / eller brist på lämpliga antikropp (Surmeier et al 1996;.. Zhou et al 2009). De…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av NIH bidrag R01DA021194 och R01NS058850.
Materials
Table 1. Key reagents and equipment
Table 2. Primer pairs for rat neuronal Kv3 channel, tyrosine hydroxylase (TH) and glutamic acid decarboxylase 1 (GAD1) mRNAs for scRT-PCR
References
- J, . Tuning pacemaker frequency of individual dopaminergic neurons by Kv4.3L and Kchip3.1 transcription. EMBO J. 20, 5715-5724 (2001).
- Surmeier, D. J., Song, W. J., Yan, Z. Coordinated expression of dopamine receptors in neostriatal medium spiny neurons. J. Neurosci. 16, 6579-6591 (1996).
- Zhou, F. W., Matta, S. G., Zhou, F. -. M. Constitutively active TRPC3 channels regulate basal ganglia output neurons. J. Neurosci. 28, 473-482 (2008).
- Zhou, F. W., Jin, Y., Matta, S. G., Xu, M., Zhou, F. -. M. An ultra-short dopamine pathway regulates basal ganglia output neurons. J. Neurosci. 29, 10424-10435 (2009).
- Ding, S., Matta, S. G., Zhou, F. -. M. Kv3-like potassium channels are required for sustained high-frequency firing in Basal Ganglia output neurons. J. Neurophysiol. 105, 554-570 (2011).
- Zhou, F. W., Xu, J. J., Zhao, Y., Ledoux, M. S., Zhou, F. -. M. Opposite functions of histamine H1 and H2 receptors and H3 receptors in substantia nigra pars reticulata. J. Neurophysiol. 96, 1581-1591 (2006).
