Dissezione Host-virus Interazione in replica litico di un Herpesvirus modello
Summary
Descriviamo un protocollo per identificare i ruoli chiave di molecole di segnalazione di accoglienza nella replicazione litica di un herpesvirus modello, gamma herpesvirus 68 (γHV68). Utilizzando ceppi di topi geneticamente modificati e fibroblasti embrionali per γHV68 replica litico, il protocollo consente sia la caratterizzazione fenotipica e molecolare del virus interrogatorio interazioni ospite-in replicazione virale litico.
Abstract
In risposta ad un'infezione virale, un ospite sviluppa varie risposte difensive, come l'attivazione immunitaria innata vie di segnalazione che portano alla produzione di citochine 1,2 antivirale. Al fine di colonizzare l'ospite, i virus sono obbligati a sottrarsi risposte dell'ospite antivirali e manipolare vie di segnalazione. Svelare l'ospite-virus interazione farà luce sullo sviluppo di nuove strategie terapeutiche contro le infezioni virali.
Murine γHV68 è strettamente correlata alla umana oncogeno sarcoma di Kaposi associato herpesvirus e Epsten-Barr 3,4. γHV68 infezione nei topi di laboratorio fornisce un modello trattabile piccolo animale per esaminare l'intero corso di risposte dell'ospite e infezione virale in vivo, che non sono disponibili per herpesvirus umani. In questo protocollo, vi presentiamo un gruppo di metodi per la caratterizzazione fenotipica e la dissezione molecolare dei componenti host di segnalazione in γHV68 Replica liticozione sia in vivo ed ex vivo. La disponibilità di ceppi di topi geneticamente modificati permette l'interrogazione dei ruoli di vie di segnalazione di accoglienza durante γHV68 infezione acuta in vivo. Inoltre, fibroblasti embrionali di topo (MEF) isolati da questi ceppi di topi deficienti può essere utilizzato per analizzare ulteriormente ruoli di queste molecole durante γHV68 litico ex vivo replica.
Utilizzo di test virologici e biologia molecolare, siamo in grado di individuare il meccanismo molecolare di ospite-virus e identificare le interazioni ospite e geni virali essenziali per la replicazione virale litico. Infine, un cromosoma artificiale batterico (BAC) sistema facilita l'introduzione di mutazioni nel fattore virale (s) che specificamente interrompere l'interazione virus-ospite. Ricombinante γHV68 portare queste mutazioni possono essere utilizzati per ricapitolare i fenotipi di γHV68 replicazione litica in MEF deficienti di accoglienza chiave componenti di segnalamento.Questo protocollo offre un'ottima strategia per interrogare interazione ospite-patogeno a più livelli di intervento in vivo e ex vivo.
Di recente, abbiamo scoperto che γHV68 usurpa un pathway di segnalazione immunitaria innata per promuovere replicazione virale litico 5. In particolare, γHV68 de novo infezione attiva il sistema immunitario IKKβ chinasi e IKKβ attivato fosforila il fattore di trascrizione virale maestro, replica e transattivatore (RTA), per la promozione virale attivazione trascrizionale. In tal modo, γHV68 efficiente coppie sua attivazione trascrizionale di ospitare attivazione immunitaria innata, facilitando così la trascrizione e la replicazione virale litico. Questo studio fornisce un esempio eccellente che può essere applicato ad altri virus per interrogare host-virus interazione.
Protocol
Discussion
In risposta ad un'infezione virale, i Mavs-dipendenti immunitarie innate vie di segnalazione sono attivati per promuovere la produzione di citochine infiammatorie antivirali 10-14. Utilizzando murino γHV68 come un virus modello per umano oncogenico sarcoma di Kaposi associato herpesvirus e virus di Epstein-Barr 3,4, abbiamo scoperto che γHV68 usurpa i Mavs-IKKβ della via per promuovere la replicazione virale litico attraverso l'attivazione trascrizionale 5. Impiegando ge…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. James (Zhijian) Chen (UT Southwestern, Biologia Molecolare) per la fornitura di reagenti essenziali, tra cui i Mavs – / – topi, e il dottor Ren Sun (University of California-Los Angeles, Farmacologia e Medicina Molecolare ) per fornire il cromosoma artificiale batterico di γHV68 per questo studio.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 |
| Electro-MAX DH10B competent cells | Invitrogen | 18290-015 |
| Methylcellulose | Sigma | M0512 |
| POWERPREP HP Plasmid Miniprep System | OriGene | NP100004 |
| POWERPREP HP Plasmid Midiprep System | OriGene | NP100006 |
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