Criando Two-Dimensional Substratos modelado para Confinamento de proteína e celular
Summary
Monocamadas auto-organizadas (SAMs) formado a partir de tióis de cadeia longa alcano em ouro proporcionar bem-definida substratos para a formação de padrões de proteínas e confinamento celular. Microcontact impressão de hexadecanethiol usando um carimbo de polidimetilsiloxano (PDMS), seguido pelo preenchimento com um glicol terminada alcano tiol monômero produz um padrão onde proteínas e células absorvem apenas para a região carimbada hexadecanethiol.
Abstract
Impressão microcontact fornece um método rápido e altamente reprodutível para a criação de substratos bem definidos padronizada. Microcontact 1 Durante a impressão pode ser empregada para imprimir diretamente um grande número de moléculas, incluindo proteínas, DNA 2, 3 e silanos, 4 a formação de auto- monocamadas (SAMs) de tióis de cadeia longa alcano em ouro fornece uma maneira simples para confinar proteínas e células para padrões específicos contendo regiões adesivo e resistente. Esse confinamento pode ser usado para controlar a morfologia das células e é útil para examinar uma variedade de questões em proteínas e biologia celular. Aqui, descrevemos um método geral para a criação de padrões bem definidos de proteínas para estudos celulares 5 Esse processo envolve três etapas:. Produção de um mestre modelado usando fotolitografia, a criação de um selo de PDMS, e microcontact impressão de um ouro substrato revestido. Uma vez modelada, estes substratos de cultura de células são capazes de proteínas confinar e / ou células (pilhas ou linhas de células) para o padrão.
O uso de auto-montagem química monocamada permite o controle preciso sobre o padrão regiões proteína / células adesivas e não adesivas regiões, o que não pode ser conseguido usando stamping proteína direta. Hexadecanethiol, a longa cadeia de tiol alcano utilizado na etapa de impressão microcontact, produz uma superfície hidrofóbica que prontamente adsorve proteína de solução. O glicol terminada tiol, utilizado para preenchimento das regiões não-impressos do substrato, cria uma monocamada que é resistente a adsorção de proteínas e, portanto, de crescimento celular. 6 Estes monômeros tiol produzir monocamadas altamente estruturado que definir com precisão as regiões do substrato que pode suportar adsorção de proteínas eo crescimento celular. Como resultado, estes substratos são úteis para uma ampla variedade de aplicações, desde o estudo do comportamento intercelular 7 para a criação de microeletrônica. 8
Enquanto outros tipos de química monocamada têm sido utilizados para estudos de cultura de células, incluindo o trabalho do nosso grupo usando trichlorosilanes para criar padrões diretamente sobre substratos de vidro, 9 monocamadas padrão formado a partir de tióis alcano em ouro são straight-forward para se preparar. Além disso, os monômeros usados para a preparação monocamada estão disponíveis comercialmente, estável, e não necessitam de armazenamento ou manipulação sob atmosfera inerte. Substratos padronizados preparados a partir de tióis alcano também pode ser reciclado e reutilizado várias vezes, mantendo confinamento na cela 10.
Protocol
Discussion
Uma série de questões podem surgir na produção litográfica do mestre utilizado para PDMS criação de selo. Subexposição dos resultados resistir revestido wafer nos padrões nebulosas e indistintas e superexposição dos resultados resistir revestido wafer em recursos alargada ou faltando. Em geral, os mestres com tamanhos recurso de grande porte (> 10 mm) são relativamente fáceis de desenvolver padrões e, ao mesmo tempo mestres com recursos menores podem exigir extensa otimização de parâmetros photopatt…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer ao grupo todo Maurer da Universidade de Washington, cujo conhecimento coletivo fez possível este protocolo. Financiamento para este trabalho é fornecido pelo Instituto Nacional de Saúde Mental (1R01MH085495).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Silicon wafer | Wafer Reclaim Services | 2 inch | |
| Spin coater/hot plate | Brewer Science | Cee 200CB Spin-Bake System | |
| AZ9245 Photoresist | Mays Chemical Company | 105880034-1160 | |
| Direct-write photolithography system | Microtech s.r.l. | LW325 LaserWriter System | |
| Mask Aligner | HTG | 3HR | |
| AZ 400K Developer | Mays Chemical Company | 105880018-1160 | |
| Sylgard 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
| 25 mm no. 1 round glass coverslips | VWR | 16004-310 | |
| Plasma Oxidizer | Diener | Femto | |
| Titanium pieces Kamis | Incorporated | 99.95% pure | |
| Gold pellets | Kamis Incorporated | 99.999% pure | |
| Electron-beam evaporator | Kurt J. Lesker | PVD 75 Thin Film Deposition System | with electron-beam accessory |
| Hexadecanethiol | Alfa Aesar | A11362 | |
| 1-mercaptoundec-11-yl)tetra(ethyleneglycol) | Sigma Aldrich | 674508 | |
| Ethanol | Pharmco-aaper | 111000200 | 200 proof, absolute |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| DPBS | VWR | 4500-434 | Without calcium and magnesium |
| Mouse Laminin I | VWR | 95036-762 | |
| Human Plasma Fibronectin | Invitrogen | 33016-015 | |
| AlexaFluor® 647 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A-20006 | |
| MitoTracker Red 580 | Invitrogen | M22425 | |
| AlexaFluor® 350 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A-10168 | |
| Anti-laminin antibody | Fisher Scientific | AB2034MI |
Referências
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