Количественная агонистично активность на G-белком рецепторы
Summary
Метод оценки сродства константа агонистом активном состоянии (<em> K<sub> Б</sub</em>) Для G-белком рецептор описывается. Анализ дает абсолютной или относительной меры<em> K<sub> Б</sub</em>, В зависимости от того, учредительные активации рецепторов измеримо. Наш метод применяется к различным вниз по течению ответы от активации рецепторов.
Abstract
Когда агонист активизирует население G-белком рецепторы (GPCR), он вызывает сигнального пути, который завершается в ответе клеток или тканей. Этот процесс может быть проанализирован на уровне одного рецептора, население рецепторов, или вниз по течению реакции. Здесь мы опишем, как анализировать ответ на выходе получить оценку агонист константа сродства для активного состояния одного рецепторов.
Рецепторы вести себя как квантовые коммутаторы, которые чередуются между активным и неактивным состояниями (рис. 1). Активном состоянии взаимодействует со специфическими белками G или другой сигнализации партнеров. В отсутствие лигандов, неактивном состоянии преобладает. Связывание агонистов увеличивает вероятность того, что рецептор переходит в активное состояние, потому что его константа сродства для активного состояния (К б) гораздо больше, чем для неактивном состоянии (К). Суммированиеслучайного выхода из всех рецепторов в популяции дает постоянный уровень активации рецептора во времени. Обратная концентрации агониста вызывая полумаксимальной активации рецептора эквивалентно наблюдается постоянная близость (K набл), а доля агонист-рецепторных комплексов в активное состояние определяется как эффективность (ε) (рис. 2).
Методы анализа вниз по течению ответы GPCRs были развиты, что позволяют оценка K набл и относительной эффективности агониста 1,2. В этом докладе показано, как изменить этот анализ для оценки агонистов К б значение относительно, что другого агониста. Для тестов, которые показывают учредительных деятельности, мы покажем, как оценить К б в абсолютных единицах М -1.
Наш метод анализа агонист реакции на концентрацию кривые 3,4 состоитглобальной нелинейной регрессии с использованием операционной модели 5. Мы описываем процедуру, используя программное приложение, Prism (GraphPad Software, Inc, Сан-Диего, Калифорния). Анализ дает оценку произведению K набл и параметр, пропорциональный эффективности (τ). Оценку тк набл одного агониста, деленная на территорию другого, является относительной мерой К Ь (РА я) 6. Для любого рецептора выставке учредительных деятельности, то можно оценить параметр, пропорциональный эффективности свободный комплекс рецепторов (τ системы). В этом случае значение К Ъ агонист эквивалентно тк затемнения / τ системы 3.
Наш метод используется для определения избирательности агонистом рецепторов подтипа и для количественного агонист-рецептор передачи сигналов через различные белки G.
Protocol
Discussion
Потому что наш метод оценки РА я (относительно К б значению) только требует измерения концентрации агониста-ответ кривые, наш анализ можно сделать в любое время эти кривые измерены.
Если изо дня в день изменения в ответе экспериментальной подготовки (нап…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным институтом здоровья Грант GM 69829.
Referências
- Stephenson, R. P. A modification of receptor theory. British Journal of Pharmacology. 11, 379-393 (1956).
- Furchgott, R. F. The use of b-haloalkylamines in the differentiation of receptors and in the determination of dissociation constants of receptor-agonist complexes. Advances in Drug Research. 3, 21-55 (1966).
- Ehlert, F. J., Suga, H., Griffin, M. T. Analysis of agonism and inverse agonism in functional assays with constitutive activity: Estimation of orthosteric ligand affinity constants for active and inactive receptor states. J. Pharmacol. Exp. Ther. 33, 671-686 (2011).
- Griffin, M. T., Figueroa, K. W., Liller, S., Ehlert, F. J. Estimation of Agonist Activity at G Protein-Coupled Receptors: Analysis of M2 Muscarinic Receptor Signaling through Gi/o,Gs, and G15. J. Pharmacol. Exp. Ther. 321, 1193-1207 (2007).
- Black, J. W., Leff, P. Operational models of pharmacological agonism. Proceedings of the Royal Society of LondonSeries B: Biological Sciences. 220, 141-162 (1983).
- Tran, J. A., Chang, A., Matsui, M., Ehlert, F. J. Estimation of relative microscopic affinity constants of agonists for the active state of the receptor in functional studies on M2 and M3 muscarinic receptors. Mol. Pharmacol. 75, 381-396 (2009).
- Schultz, J., Hamprecht, B., Daly, J. W. Accumulation of adenosine 3′:5′-cyclic monophosphate in clonal glial cells: labeling of intracellular adenine nucleotides with radioactive adenine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69, 1266-1270 (1972).
- Berridge, M. J., Downes, C. P., Hanley, M. R. Lithium amplifies agonist-dependent phosphatidylinositol responses in brain and salivary glands. Biochemical Journal. 206, 587-595 (1982).
- Kendall, D. A., Hill, S. J. . Methods in Neurotransmitter Receptor Analysis. , 68-87 (1990).
- Pulido-Rios, M. Vitro Isolated Tissue Functional Muscarinic Receptor Assays. Current Protocols in Pharmacology. 48, 4-15 (2010).
- Kenakin, T., Enna, S. J. . Current Protocols in Pharmacology. , (2001).
- Ehlert, F. J., Griffin, M. T., Sawyer, G. W., Bailon, R. A. simple method for estimation of agonist activity at receptor subtypes: comparison of native and cloned M3 muscarinic receptors in guinea pig ileum and transfected cells. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 289, 981-992 (1999).
- Burstein, E. S., Spalding, T. A., Brann, M. R. Pharmacology of muscarinic receptor subtypes constitutively activated by G proteins. Mol. Pharmacol. 51, 312-319 (1997).
