Kvantificering agonistaktivitet på G-protein-koblede receptorer
Summary
En metode til at anslå affinitetskonstant af en agonist for den aktive tilstand (<em> K<sub> B</sub</em>) Af en G-protein-koblede receptorer er beskrevet. Analysen giver absolut eller relativ foranstaltninger<em> K<sub> B</sub</em> Afhængig af, om konstituerende receptor-aktivering er målbar. Vores metode gælder for de forskellige svar nedstrøms fra receptor aktivering.
Abstract
Når en agonist aktiverer en population af G-protein-koblede receptorer (GPCRs), det fremkalder en signalvej, der kulminerer i svaret fra den celle eller væv. Denne proces kan analyseres på niveau med en enkelt receptor, en befolkning på receptorer, eller en downstream svar. Her beskriver vi, hvordan at analysere det efterfølgende reaktion at opnå et estimat af de agonist affinitetskonstant til aktiv tilstand enkelt receptorer.
Receptorer opfører sig som kvantemekaniske switche, der veksler mellem aktive og inaktive stater (Figur 1). Den aktive tilstand interagerer med specifikke G proteiner eller andre signalering partnere. I mangel af ligander, dominerer den inaktive tilstand. Bindingen af agonist øges sandsynligheden for, at receptoren vil skifte til aktiv tilstand, fordi dens affinitetskonstant til aktiv tilstand (K b) er meget større end for den inaktive tilstand (K a). Sammenlægning af detilfældige udgange af alle de receptorer i befolkningen giver et konstant niveau af receptor-aktivering i tide. Den reciprokke værdi af koncentrationen af agonist fremkalde halv maksimal receptor aktivering svarer til den observerede affinitetskonstant (K OBS), og den fraktion af agonist-receptor komplekser i den aktive tilstand er defineret som effekten (ε) (Figur 2).
Metoder til at analysere de efterfølgende reaktioner GPCRs er blevet udviklet, der muliggør estimering af K OBS og relative effekt af en agonist 1,2. I denne rapport, viser vi, hvordan du ændrer denne analyse at estimere agonist K b værdi i forhold til en anden agonist. For analyser som udviser konstitutive aktivitet, viser vi, hvordan at estimere K b i absolutte enheder af M -1.
Vores metode til at analysere agonist koncentrations-respons kurver 3,4 beståraf den globale ikke-lineær regression ved hjælp af operationelle model 5. Vi beskriver en procedure, ved hjælp af programmet, Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Analysen giver et estimat af produktet af K obs. og en parameter i forhold til effekten (τ). Skønnet over τK obs. af en agonist, divideret med en anden, er et relativt mål for K b (RA i) 6. For enhver receptor udstille konstitutiv aktivitet, er det muligt at estimere et parameter i forhold til effekten af det frie receptor komplekset (τ sys). I dette tilfælde er K b værdien af en agonist, der svarer til τK obs. / τ sys 3.
Vores metode er nyttig til bestemmelse af selektivitet af en agonist for receptor subtyper og for kvantificering af agonist-receptor-signalering gennem forskellige G-proteiner.
Protocol
Discussion
Fordi vores metode til at anslå RA i (relativ K b værdi) kræver kun måling af agonist koncentration-respons kurver, kan vores analyse gøres når som helst disse kurver måles.
Hvis dag-til-dag variation i svaret fra den eksperimentelle forberedelse (f.eks celler eller væv) er stor, kan svaret målinger af hver koncentration-responskurve være normaliseret i forhold til "Top" estimat af standarden agonist for hver dag, eksperiment. Et sk…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af en National Institutes of Health Grant GM-69829.
Referências
- Stephenson, R. P. A modification of receptor theory. British Journal of Pharmacology. 11, 379-393 (1956).
- Furchgott, R. F. The use of b-haloalkylamines in the differentiation of receptors and in the determination of dissociation constants of receptor-agonist complexes. Advances in Drug Research. 3, 21-55 (1966).
- Ehlert, F. J., Suga, H., Griffin, M. T. Analysis of agonism and inverse agonism in functional assays with constitutive activity: Estimation of orthosteric ligand affinity constants for active and inactive receptor states. J. Pharmacol. Exp. Ther. 33, 671-686 (2011).
- Griffin, M. T., Figueroa, K. W., Liller, S., Ehlert, F. J. Estimation of Agonist Activity at G Protein-Coupled Receptors: Analysis of M2 Muscarinic Receptor Signaling through Gi/o,Gs, and G15. J. Pharmacol. Exp. Ther. 321, 1193-1207 (2007).
- Black, J. W., Leff, P. Operational models of pharmacological agonism. Proceedings of the Royal Society of LondonSeries B: Biological Sciences. 220, 141-162 (1983).
- Tran, J. A., Chang, A., Matsui, M., Ehlert, F. J. Estimation of relative microscopic affinity constants of agonists for the active state of the receptor in functional studies on M2 and M3 muscarinic receptors. Mol. Pharmacol. 75, 381-396 (2009).
- Schultz, J., Hamprecht, B., Daly, J. W. Accumulation of adenosine 3′:5′-cyclic monophosphate in clonal glial cells: labeling of intracellular adenine nucleotides with radioactive adenine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69, 1266-1270 (1972).
- Berridge, M. J., Downes, C. P., Hanley, M. R. Lithium amplifies agonist-dependent phosphatidylinositol responses in brain and salivary glands. Biochemical Journal. 206, 587-595 (1982).
- Kendall, D. A., Hill, S. J. . Methods in Neurotransmitter Receptor Analysis. , 68-87 (1990).
- Pulido-Rios, M. Vitro Isolated Tissue Functional Muscarinic Receptor Assays. Current Protocols in Pharmacology. 48, 4-15 (2010).
- Kenakin, T., Enna, S. J. . Current Protocols in Pharmacology. , (2001).
- Ehlert, F. J., Griffin, M. T., Sawyer, G. W., Bailon, R. A. simple method for estimation of agonist activity at receptor subtypes: comparison of native and cloned M3 muscarinic receptors in guinea pig ileum and transfected cells. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 289, 981-992 (1999).
- Burstein, E. S., Spalding, T. A., Brann, M. R. Pharmacology of muscarinic receptor subtypes constitutively activated by G proteins. Mol. Pharmacol. 51, 312-319 (1997).
