Kwantificeren agonistische activiteit heeft op G eiwit-gekoppelde receptoren

Summary

Een methode voor het schatten van de affiniteit constante van een agonist voor de actieve toestand (<em> K<sub> B</sub</em>) Van een G-eiwit gekoppelde receptor is beschreven. De analyse levert absolute of relatieve maatregelen van<em> K<sub> B</sub</em> Afhankelijk van of constitutieve receptor activering meetbaar is. Onze methode is van toepassing op de verschillende reacties stroomafwaarts van receptor activering.

Abstract

Wanneer een agonist een populatie van G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR's) activeert, het ontlokt een signaalweg die culmineert in de reactie van de cel of weefsel. Dit proces kan worden geanalyseerd op het niveau van een enkele receptor, een populatie van receptoren, of een stroomafwaarts reactie. Hier beschrijven we hoe u de downstream-respons te analyseren om een ​​schatting van de agonist affiniteit constante voor de actieve toestand van enkele receptoren te verkrijgen.

Receptoren zich gedragen als quantale schakelaars die afwisselend actieve en inactieve staten (figuur 1). De actieve toestand interageert met specifieke G-eiwitten of andere signalisatie partners. Bij afwezigheid van liganden, de inactieve toestand overheerst. De binding van agonist verhoogt de kans dat de receptor zal schakelaar in de actieve toestand, omdat de affiniteit constante voor de actieve toestand (K _b) is veel groter dan die voor de inactieve toestand (K _a). De sommatie van dewillekeurige uitgangen van alle van de receptoren in de populatie levert een constant niveau van receptor activering in de tijd. Het omgekeerde van de concentratie van de agonist uitlokken half-maximale receptor activering is gelijk aan de waargenomen affiniteitsconstante (K _OBS), en de fractie van de agonist-receptor complexen in de actieve toestand is gedefinieerd als effectiviteit (ε) (figuur 2).

Methoden voor het analyseren van de downstream reacties van GPCR's zijn ontwikkeld waarmee de schatting van de K _obs en de relatieve werkzaamheid van een agonist ^1,2. In dit rapport laten we zien hoe deze analyse te wijzigen om de agonist K _b-waarde ten opzichte van die van een ander agonist te schatten. Voor de testen die constitutieve activiteit vertonen, laten we zien hoe de K _b schatting in absolute eenheden van M ^-1.

Onze methode van het analyseren agonist concentratie-respons curves ^3,4 bestaat uitvan de wereldwijde niet-lineaire regressie met behulp van het operationele model ^5. We beschrijven een procedure met behulp van de software-applicatie, Prism (GraphPad Software, Inc, San Diego, CA). De analyse levert een schatting van het product van K _OBS en een parameter evenredig aan werkzaamheid (τ). De schatting van τK _obs van een agonist, gedeeld door dat van een ander, is een relatieve maatstaf van K _b (RA _i) ^6. Voor elke receptor constitutieve activiteit vertonen, is het mogelijk in te schatten van een parameter in verhouding tot de werkzaamheid van de vrije receptor complex (τ _sys). In dit geval, de K _b waarde van een agonist is gelijk aan τK _obs / τ _sys ^3.

Onze methode is handig voor het bepalen van de selectiviteit van een agonist voor de receptor subtypes en voor de kwantificering van agonist-receptor-signalering door middel van verschillende G-eiwitten.

Protocol

1. Meting van de agonist concentratie-respons curves: geen constitutieve activiteit Voor de schatting van de relatieve agonist K b-waarden (RA i), is een reeks van ten minste twee agonist concentratie-respons curves vereist. Elke in vitro test voor de functionele respons van een GPCR gemeten kan worden op voorwaarde dat de concentratie van de agonist kan worden gecontroleerd en een enkel type van receptor medieert de reactie. Geschikte cel-gebaseerde testen omvatten de …

Discussion

Omdat onze methode voor het schatten van RA _i (relatieve K _b-waarde) alleen vereist de meting van de agonist concentratie-respons curves, kan onze analyse gedaan worden altijd deze curves worden gemeten.

Als dag-tot-dag variatie in de reactie van de experimentele opstelling (bv, cellen of weefsel) groot is, kan de respons metingen van elke concentratie-respons-curve ten opzichte van de "Top"-raming van de standaard-agonist voor genormaliseerd…