כימות פעילות אגוניסט ב G-חלבון יחד רצפטורים
Summary
שיטה להערכת הזיקה המתמדת של אגוניסט למדינה פעיל (<em> K<subB></sub</em>) של קולטני G-חלבון בשילוב מתואר. הניתוח מספק אמצעים מוחלט או יחסי של<em> K<subB></sub</em> תלוי אם הפעלת קולטן המכונן הוא מדיד. השיטה שלנו חל במורד התגובות השונות של הפעלת הקולטן.
Abstract
כאשר אגוניסט מפעיל אוכלוסייה של G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs), זה מעורר מסלול איתות זה מגיע לשיאו בתגובה של התא או הרקמה. תהליך זה יכול להיות מנותח ברמה של קולטן יחיד, אוכלוסייה של קולטנים, או תגובה במורד הזרם. כאן אנו מתארים כיצד לנתח את התגובה במורד הזרם כדי לקבל אומדן של הזיקה אגוניסט מתמדת המדינה הפעילה של קולטנים יחיד.
רצפטורים להתנהג כמו מתגים quantal כי חלופי בין מדינות פעיל פעיל (איור 1). המצב הפעיל אינטראקציה עם חלבונים ספציפיים G או שותפים איתות אחרים. בהעדר ligands, המדינה לא פעיל השולט. הכריכה של אגוניסט מעלה את ההסתברות כי קולטן יעבור למצב פעיל בגלל זיקה מתמדת למדינת פעיל (K ב) שלו הוא גדול בהרבה מזה של מדינת פעיל (K). סיכום שליציאות אקראיות של כל הקולטנים באוכלוסייה התשואות על רמה קבועה של הפעלת קולטן בזמן. הגומלין של ריכוז של אגוניסט לעורר חצי מקסימלי הפעלת קולטן שווה מתמיד את הזיקה שנצפו (K obs), וכן את החלק היחסי של אגוניסט קולטן מתחמי במצב פעיל מוגדר יעילות (ε) (איור 2).
שיטות לניתוח התגובות במורד הזרם של GPCRs פותחו המאפשרים הערכה של K obs ואת היעילות היחסית של 1,2 אגוניסט. בדו"ח זה, אנו מראים כיצד לשנות את הניתוח הזה כדי להעריך את ערך K אגוניסט b ביחס לזה של אגוניסט אחר. עבור מבחני כי התערוכה פעילות המכונן, אנו מראים כיצד להעריך K b ביחידות המוחלט של M -1.
השיטה שלנו לניתוח ריכוז בתגובה אגוניסט עקומות 3,4 מורכברגרסיה ליניארית הגלובלית באמצעות מודל מבצעי 5. אנו מתארים הליך באמצעות יישום תוכנה, פריזמה (GraphPad תוכנה, Inc, סן דייגו, קליפורניה). ניתוח התשואות אומדן של המכפלה של K ו obs פרמטר יחסי היעילות (τ). אומדן τK obs של אגוניסט אחד, מחולק כי אחרת, היא מדד יחסי של K b (ע"ר i) 6. במשך כל קולטן מפגין פעילות מכוננת, אפשר להעריך פרמטר יחסי היעילות של קומפלקס הקולטן חינם (τ sys). במקרה זה, הערך של K b אגוניסט שווה τK obs / τ sys 3.
השיטה שלנו הוא שימושי לקביעת הסלקטיביות של אגוניסט עבור תת קולטן לכימות אגוניסט קולטן חלבוני איתות דרך שונה G.
Protocol
Discussion
בגלל השיטה שלנו להערכת RA אני (יחסית לערך K ב) רק דורש מדידת ריכוז בתגובה עקומות אגוניסט, הניתוח שלנו ניתן לעשות זאת בכל עת עקומות אלה נמדדים.
אם יום יומית וריאציה בתגובה של הכנת הניסוי (למשל, תאים או רקמות) הוא גדול, ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים גרנט GM 69829.
Referências
- Stephenson, R. P. A modification of receptor theory. British Journal of Pharmacology. 11, 379-393 (1956).
- Furchgott, R. F. The use of b-haloalkylamines in the differentiation of receptors and in the determination of dissociation constants of receptor-agonist complexes. Advances in Drug Research. 3, 21-55 (1966).
- Ehlert, F. J., Suga, H., Griffin, M. T. Analysis of agonism and inverse agonism in functional assays with constitutive activity: Estimation of orthosteric ligand affinity constants for active and inactive receptor states. J. Pharmacol. Exp. Ther. 33, 671-686 (2011).
- Griffin, M. T., Figueroa, K. W., Liller, S., Ehlert, F. J. Estimation of Agonist Activity at G Protein-Coupled Receptors: Analysis of M2 Muscarinic Receptor Signaling through Gi/o,Gs, and G15. J. Pharmacol. Exp. Ther. 321, 1193-1207 (2007).
- Black, J. W., Leff, P. Operational models of pharmacological agonism. Proceedings of the Royal Society of LondonSeries B: Biological Sciences. 220, 141-162 (1983).
- Tran, J. A., Chang, A., Matsui, M., Ehlert, F. J. Estimation of relative microscopic affinity constants of agonists for the active state of the receptor in functional studies on M2 and M3 muscarinic receptors. Mol. Pharmacol. 75, 381-396 (2009).
- Schultz, J., Hamprecht, B., Daly, J. W. Accumulation of adenosine 3′:5′-cyclic monophosphate in clonal glial cells: labeling of intracellular adenine nucleotides with radioactive adenine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69, 1266-1270 (1972).
- Berridge, M. J., Downes, C. P., Hanley, M. R. Lithium amplifies agonist-dependent phosphatidylinositol responses in brain and salivary glands. Biochemical Journal. 206, 587-595 (1982).
- Kendall, D. A., Hill, S. J. . Methods in Neurotransmitter Receptor Analysis. , 68-87 (1990).
- Pulido-Rios, M. Vitro Isolated Tissue Functional Muscarinic Receptor Assays. Current Protocols in Pharmacology. 48, 4-15 (2010).
- Kenakin, T., Enna, S. J. . Current Protocols in Pharmacology. , (2001).
- Ehlert, F. J., Griffin, M. T., Sawyer, G. W., Bailon, R. A. simple method for estimation of agonist activity at receptor subtypes: comparison of native and cloned M3 muscarinic receptors in guinea pig ileum and transfected cells. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 289, 981-992 (1999).
- Burstein, E. S., Spalding, T. A., Brann, M. R. Pharmacology of muscarinic receptor subtypes constitutively activated by G proteins. Mol. Pharmacol. 51, 312-319 (1997).
